Genetyka bakterii. Skrypt do ćwiczeń UW. 2016.pdf

(549 KB) Pobierz
GENETYKA BAKTERII
Materiały do ćwiczeń
Przygotowane przez zespół pracowników
Zakładu Genetyki Bakterii
Zakład Genetyki Bakterii
Instytut Mikrobiologii
Wydział Biologii
Uniwersytet Warszawski
2016
1
SPIS TREŚCI
1.
Mutageneza transpozonowa
1.1. Przeprowadzenie koniugacji szczepu zawierającego plazmid z Tn1 ze
szczepami biorców
E. coli
lub
S. marcescens
dającymi możliwość
eliminacji z mieszaniny koniugacyjnej szczepu dawcy
1.2. Wyselekcjonowanie transkoniugantów, do których został przeniesiony
plazmid zawierający transpozon Tn1
Odszukanie wśród transkoniugantów (drogą analizy fenotypu) frakcji
1.3
klonów, w których insercja kasety transpozycyjnej spowodowała
inaktywację genu poddawanego mutagenezie
1.4. Potwierdzenie obecności transpozonu w genomach mutantów
transpozonowych z wykorzystaniem procedury odzyskania plazmidu
2. Mutageneza spontaniczna i indukowana
2.1. Zbadanie częstości rewersji spontanicznych w szczepie
E. coli
AB1157 oraz w szczepie z mutacją w genie
mut
2.2. Zbadanie częstości mutacji indukowanych UV, MMS i EMS w
szczepie AB1157 i w AB1157 z delecją
umuDC
Test „Rec-assay” z wykorzystaniem wybranych szczepów
E. coli
3.
3.1. Badanie zwiększonego działania letalnego związków mutagennych
na komórki
E. coli
posiadające mutacje w genach
rec
4. Biofilmy bakteryjne
4.1.
Metoda barwienia fioletem krystalicznym
5. Transdukcja ogólna przy udziale faga P1
5.1. Otrzymanie lizatu fagowego o odpowiednio dużym mianie faga i
możliwie dużej zawartości cząstek transdukujących, mianowanie lizatu
5.2. Zainfekowanie lizatem fagowym odpowiedniego szczepu biorcy.
Zbadanie wpływu fenotypu szczepu biorcy (Rec
+
lub Rec-) na wynik
przekazywania genów chromosomowych i plazmidowych.
Szczegółowa
analiza
transduktantów
(weryfikacja
fenotypu
5.3
oczyszczonych transduktantów, stwierdzenie występowania kotrandukcji
pewych cech).
6. Oczyszczanie białek bakteryjnych i badanie ich zdolności do interakcji z
DNA
6.1. Nadprodukcja zrekombinowanego białka antytoksyny
6.2. Przygotowanie żelu poliakryloamidowego i elektroforeza białek
7. Badanie interakcji białek
7.1. Reakcja sieciowania białek za pomocą aldehydu glutarowego
7.2. Wizualizacja produktów reakcji sieciowania białek
8. Podłoża
9. Metody
10. Zalecana literatura
str. 3
str. 6
str. 8
str. 9
str. 10
str. 13
str.16
str. 18
str. 19
str. 24
2
1.
Mutageneza transpozonowa
Wykorzystanie wektora niosącego kasetę transpozycyjną do mutagenizacji genu
gfp
zlokalizowanego na plazmidzie
E.coli
oraz genów chromosomowych
Serratia marcescens
Transpozony (Tn) należą do elementów transpozycyjnych, a więc ruchomych elementów
genetycznych zdolnych do zmiany miejsca w genomie w wyniku procesu zwanego transpozycją.
Transpozycja jest typem rekombinacji nieuprawnionej, która nie wymaga homologii sekwencji
nukleotydowych cząsteczek DNA uczestniczących w tym procesie i zależy od enzymu transpozazy
kodowanej przez Tn. Wyróżnia się dwa mechanizmy transpozycji: konserwatywny i replikacyjny.
Tn zwykle niosą geny warunkujące różne cechy fenotypowe. Dzielimy je na transpozony
złożone, charakteryzujące się obecnością na obu końcach sekwencji insercyjnych, które okalają
część centralną, niosącą geny niezwiązane z transpozycją, i Tn niezłożone, przypominające budową
sekwencje insercyjne, lecz niosące geny kodujące cechy fenotypowe.
Plazmid samobójczy pDSTn1 wykorzystywany na ćwiczeniach niesie kasetę transpozycyjną
Tn1 zawierającą gen oporności na kanamycynę. Nośnik kasety transpozycyjnej jest plazmidem
mobilizowalnym. Dodatkowo jest wyposażony w gen lewanosacharazy (sacB), co pozwala na
eliminację z puli uzyskanych mutantów klonów, w których doszło do integracji całego plazmidu z
genomem biorcy. Schemat plazmidu pDSTn1 przedstawiono na rycinie 1.
tnp
IR
Km
R
ori
R6K
IR
PDSTn1
9,3 kpz
ori
R6K
sacB
Cm
R
Mob
Ryc. 1. Schemat plazmidu samobójczego do mutagenezy transpozonowej
Celem ćwiczenia jest wykorzystanie mutagenezy transpozonowej do:
1. insercyjnej inaktywacji genu
gfp
występującego w obrębie plazmidu szczepu
E. coli
TG1
2. insercyjnej inaktywacji genów chromosomowych
Serratia marcescens,
3. stworzenia fuzji transkrypcyjnej z genami chromosomowymi warunkującymi ruchliwość
Pseudomonas aeruginosa
3
Ćwiczenie 1, 2, 3 - mutageneza transpozonowa
Wykorzystanie wektorów niosących kasety transpozycyjne do mutagenizacji genu
gfp
zlokalizowanego na plazmidzie
E. coli,
genów chromosomowych
Serratia marcescens
i
Pseudomonas aeruginosa
Eksperyment obejmuje następujące etapy:
1) Przeprowadzenie koniugacji
1. szczepu
E. coli
S-17 zawierającego plazmid z Tn1 ze szczepem biorcy
S. marcescens
2. szczepu
E. coli
S-17 niosącego kasetę Tn5 ze szczepem
P. aeruginosa.
2) Przeprowadzenie transformacji szczepu
E. coli gfp
+
plazmidem pDSTn1 niosącym Tn1
3) Wyselekcjonowanie transkoniugantów/transformantów, do których został przeniesiony
plazmid zawierający transpozon Tn1 lub Tn5
4) Odszukanie wśród transkoniugantów/transformantów (drogą analizy fenotypu) frakcji
klonów, w których insercja kasety transpozycyjnej spowodowała inaktywację genu
poddawanego mutagenezie.
5) Potwierdzenie obecności transpozonu w genomach mutantów
z wykorzystaniem procedury odzyskania plazmidu lub PCR.
transpozonowych
Szczepy:
E. coli
S17-1 (pDSTn1; Kan
R
)
E. coli
TG1 (pSB1A2gfp; Rif
R
, Amp
R
)
E.coli
S17-1 (pSUP101Tn5-B22; Gm
R
)
S. marcescens
(Rif
R
)
P. aeruginosa
ATCC 10145 (Amp
R
)
Podłoża, roztwory i inne:
- podłoże LB i LA
- roztwory rifampicyny, ampicyliny,
kanamycyny, gentamycyny, sacharozy
- roztwory do izolacji totalnego DNA
- roztwory do izolacji plazmidowego DNA
- roztwory do transformacji metodą
wapniowo-rubidową
- ligaza, bufor do ligazy
- endonukleaza restrykcyjna MluI
Dzień 1
1) Przeprowadzić koniugację szczepu
E. coli
S17-1 (pDSTn1; Kan
R
), będącego dawcą, ze
szczepem biorcy
S. marcescens
(Rif
R
)
Koniugację wykonać poprzez zmieszanie logarytmicznych hodowli biorcy i dawcy
(hodowle odpłukane od antybiotyków) w proporcji 1:1 (0,5 ml biorcy i 0,5 ml dawcy).
Mieszaniny koniugacyjne inkubować 2-3 godzin w 30°C na szalce Petriego
z podłożem LA.
Po inkubacji mieszaniny koniugacyjne wysiać na podłoże selekcyjne:
LA
4
z kanamycyną, rifampicyną (50 μg/ml) i sacharozą (20%). Płytki inkubować przez 24
godz. w 30°C.
Transkoniuganty będą następnie selekcjonowane na podstawie różnic w zabawieniu
kolonii w porównaniu z koloniami biorców. Wybrane transkoniuganty zostaną przesiane
na szalki z odpowiednim podłożem.
2) Przeprowadzić koniugację szczepu
E. coli
S17-1 (pSUP101Tn5-B22; Gm
R
), będącego dawcą,
ze szczepem biorcy
P. aeruginosa
(Amp
R
)
Koniugację wykonać poprzez zmieszanie logarytmicznych hodowli biorcy i dawcy
(hodowle odpłukane od antybiotyków) w proporcji 1:10 (0,1 ml biorcy i 1 ml dawcy).
Mieszaniny koniugacyjne inkubować 2-3 godzin w 30°C na szalce Petriego
z podłożem LA.
Po inkubacji mieszaninę koniugacyjną wysiać na podłoże selekcyjne: LA z gentamycyną
(10 μg/ml), ampicyliną (100 μg/ml), X-gal (50 μg/ml). Płytki inkubować przez 24 godz.
w 37°C.
Koniuganty
P. aeruginosa
będą selekcjonowane na podstawie różnic w zabawieniu
kolonii (kolonie białe i niebieskie). Wybrane transkoniuganty zostaną przesiane na
szalki z odpowiednim podłożem.
3) Przygotować komórki kompetentne
E. coli
TG1 (pSB1A2gfp; Rif
R
, Amp
R
) metodą wapniowo-
rubidową. Komórki transformować otrzymanym plazmidem pDSTn1; Kan
R
, będącym donorem
transpozonu Tn1.
Po transformacji komórki wysiać na podłoże selekcyjne: LA z kanamycyną (50 μg/ml),
ampicyliną (100 μg/ml), rifampicyną (50 μg/ml). Płytki inkubować 24 godz. w 37°C.
Transformanty będą selekcjonowane na podstawie różnic w zabawieniu kolonii
w porównaniu z koloniami szczepy wyjściowego. Wybrane transformanty zostaną
przesiane na szalki z odpowiednim podłożem.
Dzień 2
1. Z wyselekcjonowanych uprzednio klonów mutantów
S. marcescens
wyizolować totalne
DNA.
2. Wykonać trawienie totalnego DNA
S. marcescens
endonukleazą restrykcyjną MluI,
a następnie autoligację strawionego DNA.
3. Przygotować komórki kompetentne
E. coli
DH5αλpir transformować mieszaniną ligacyjną,
następnie wysiać na podłoże selekcyjne: szalki LA z kanamycyną, 50 μg/ml i inkubować 24
h w 37°C.
4. Wykonać testy fenotypowe wyselekcjonowanych koniugantów
P. aeruginosa:
sprawdzić
zmiany w zdolności mutantów do ruchu typu „swimming” i „twiching” w porównaniu ze
szczepem dzikim:
Hodowle nocne wyselekcjonowanych mutantów transpozonowych pobrać z płytki
Petriego za pomocą sterylnej wykałaczki i zaszczepić podłoże LA zestalone 0,3%
agarem przez wkłucie wykałaczki (badanie zdolności do ruchu typu swarming).
Inkubować 24 h w 37°C..
Za pomocą sterylnej wykałaczki, jak powyżej, punktowo zaszczepić płytkę z podłożem
LA zestalonym 1% agarem dotykając wykałaczką dna szalki (badanie zdolności do
ruchu typu twiching). Inkubować 24 h w 37°C.
5

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin