MIKROBIOLOGIA – mgr Paulina Usarek
Barwienie metodą Ziehl-Nelsena - w bakteriologii rodzaj techniki diagnostycznej służącej do odróżniania bakterii kwasoopornych i niekwasoopornych (diagnostyka gruźlicy).
1. Na utrwalony rozmaz bakterii na odtłuszczonym szkiełku podstawowym nanosimy barwnik podstawowy (stężona fuksyna) na 15 min. W trakcie barwienia podgrzewamy preparat palnikiem, nie dopuszczając jednak do wrzenia
2. Zlewamy barwnik. Nie spłukujemy wodą destylowaną (niektóre źródła podają, że się spłułukuje preparat wodą)
3. po wystudzeniu odbarwiamy preparat w 3% roztworze HCl w etanolu (kwaśny alkohol) – 1 minuta
4. Spłukujemy wodą destylowaną
5. Nanosimy barwnik kontrastowy, np. błękit metylenowy na 1 min.
6. Spłukujemy wodą destylowaną
7. Suszymy preparat na pasku bibuły, w temperaturze pokojowej i przeprowadzamy obserwacje w mikroskopie świetlnym z zastosowaniem imersji
W wyniku takiego postępowania bakterie kwasooporne przybierają kolor czerwony pochodzący od fuksyny (nie odbarwiają się one bowiem w kwaśnym alkoholu). Natomiast bakterie niekwasooporne są wrażliwe na działanie kwaśnego alkoholu, odbarwiają się w nim z fuksyny i mają kolor niebieski od błękitu metylenowego.
PODŁOŻA DO HODOWLI PRĄTKÓW:
Podłoże Löwensteina-Jensena, zwane czasem podłożem Löwensteina lub LJ – pożywka używana do hodowli prątków. Czas od posiewu do detekcji drobnoustroju wynosi średnio 21 dni. Jest to podłoże namnażająco-wybiórcze. Najczęściej ma postać skosu w probówce.
Podłoże składa się zazwyczaj z wody destylowanej, mąki ziemniaczanej, L-asparaginy (źródło azotu), glicerolu (źródło węgla) oraz roztworu soli – siarczanu magnezu, cytrynianu magnezowego i fosforanu jednopotasowego. Następnie w sposób możliwie jałowy do roztworu dawana jest masa jajowa. Ostatnim składnikiem jest zieleń malachitowa – większość drobnoustrojów ginie w obecności tego związku, natomiast prątki są oporne i wzrastają w jego obecności. Po przygotowaniu, pożywkę należy wyjałowić. Zachowuje ona swoje właściwości przez około cztery tygodnie.
Modyfikacją podłoża Loewensteina-Jensena jest podłoże Ogawy, które zawiera zamiast asparaginy glutaminian sodu. Inną modyfikacją podłoża LJ jest pożywka Stonebrinka – zamiast asparaginy zawiera pirogronian sodu.
Podłoże Middlebrooka– stałe, agarowe, nieselektywne podłoże hodowlane używane do hodowli prątków. Jest to pożywka wzbogacona i częściowo wybiórcza. Zawiera zieleń malachitową. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanego podłoża Löwensteina-Jensena jest przezroczyste, więc małe kolonie mogą być zaobserwowane wcześniej. Czas od posiewu do wykrycia drobnoustroju wynosi średnio 17 dni.
W 1949 Dubos i Middlebrook opracowali płynne podłoże 7H9. Podłoże 7H9 może być używane ciągle do diagnostyki plwociny. Jest to wersja płynna podłoża – zawiera: sola mineralne, glukozę, albuminę, glicerol, kwas oleinowy, witaminy, czynniki wzrostowe, katalazę. Jest to uniwersalna pożywka stosowana w diagnostyce gruźlicy i mykobakterioz.
W 1958 opracowano stałe podłoże 7H10 (to samo co 7H9, ale zestalone agarem), a 10 lat później je jeszcze ulepszono 7H11 (zestalone agarem, zawiera dodatkowo hydrolizat kazeiny).
W przyspieszonych, automatycznych systemach hodowli prątków podłoża 7H9 i 7H11 są uzupełniane dodatkiem antybiotyków i chemioterapeutyków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybicznych w celu zwiększenia ich selektywności – są to najczęściej: polimysyna, wankomycyna, kwas nalidyksowy, trimetoprim, amfoterycyna B w różnych zestawieniach.
Literatura:
Wikipedia
Diagnostyka bakteriologiczna – red. naukowy Eligia Szewczyk
1
Lauviah666