Owady żerujące na zwłokach jako alternatywne źródło ludzkiego materiału genetycznego - AMSIK_Art_24909.pdf

(539 KB) Pobierz
Arch Med Sąd Kryminol 2014; 64 (4): 254–267
DOI: 10.5114/amsik.2014.50530
archiwum medycyny sądowej i kryminologii
Praca poglądowa
Review paper
Rafał Skowronek, Marcin Tomsia, Kornelia Droździok, Jadwiga Kabiesz
Owady żerujące na zwłokach jako alternatywne źródło
ludzkiego materiału genetycznego
Insects feeding on cadavers as an alternative source of human
genetic material
Katedra i Zakład Medycyny Sądowej i Toksykologii Sądowo-Lekarskiej, Wydział Lekarski w Katowicach, Śląski Uniwersytet Medyczny
w Katowicach, Polska
Department of Forensic Medicine and Forensic Toxicology, School of Medicine in Katowice, Medical University of Silesia, Katowice,
Poland
Streszczenie
W niektórych sprawach kryminalnych wykorzystanie klasycznych źródeł ludzkiego materiału genetycznego jest utrud­
nione lub nawet niemożliwe. Rozwiązaniem może być wykorzystanie owadów, zwłaszcza larw muchówek, żerujących
na zwłokach. Aktualny przegląd opisów przypadków oraz badań eksperymentalnych dostępnych w bazach biomedycz­
nych wykazał, że owady mogą stanowić cenne źródło ludzkiego kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), zarówno
mitochondrialnego, jak i genomowego, umożliwiającego efektywną analizę, odpowiednio sekwencji regionów hiper­
zmiennych (HVR) i profili krótkich powtórzeń tandemowych (STR). Optymalnym źródłem ludzkiego DNA jest wole
(część jelita) aktywnych larw muchówek III stadium.
Puparia
i wydaliny owadów również mogą być wykorzystane
w praktyce genetyczno­sądowej zamiast zawartości przewodu pokarmowego.
Słowa kluczowe:
entomologia sądowa, genetyka sądowa, larwy muchówek, identyfikacja osobnicza.
Abstract
In some criminal cases, the use of classical sources of human genetic material is difficult or even impossible. One so­
lution may be the use of insects, especially blowfly larvae which feed on corpses. A recent review of case reports and
experimental studies available in biomedical databases has shown that insects can be a valuable source of human mito­
chondrial and genomic deoxyribonucleic acid (DNA), allowing for an effective analysis of hypervariable region (HVR)
sequences and short tandem repeat (STR) profiles, respectively. The optimal source of human DNA is the crop (a part
of the gut) of active third­instar blowfly larvae. Pupae and insect faeces can be also used in forensic genetic practice
instead of the contents of the alimentary tract.
Key words:
forensic entomology, forensic genetics, blowfly larvae, personal identification.
Wprowadzenie
Entomologia sądowa stopniowo zyskuje coraz
większe uznanie wśród przedstawicieli organów ści­
Copyright © 2014 by PTMSiK
Introduction
Forensic entomology has been steadily gaining
recognition from representatives of law enforcement
Arch Med Sąd Kryminol 2014; vol. 64: 254–267
gania i  wymiaru sprawiedliwości na całym świecie,
w tym także w Polsce [1]. Jest to spowodowane m.in.
stale rosnącą liczbą możliwych zastosowań owadów
nekrofilnych i ich pozostałości w miejscu ujawnienia
zwłok (tzw. śladów entomologicznych) w  medycy­
nie, toksykologii i genetyce sądowej [2]. Obecnie ich
zakres zdecydowanie wykracza poza klasyczne sza­
cowanie czasu zgonu metodą entomologiczną [3].
Można zauważyć, że w  obrębie samej entomologii
sądowej wyodrębniają się nowe subdyscypliny, takie
jak entomotoksykologia, „wirtualna” entomologia
sądowa, archeoentomologia funeralna itp. [4–6].
Jedną z nowszych, możliwych aplikacji materia­
łu entomologicznego jest wykorzystanie treści po­
karmowej jelita owadów (głównie larw muchówek)
żerujących na zwłokach ludzkich i ich wydalin jako
alternatywnego źródła ludzkiego materiału gene­
tycznego, pozwalającego na analizę sekwencji geno­
mowego i mitochondrialnego DNA (mtDNA) [7, 8].
Analiza genetyczna pokarmu spożytego przez owa­
dy nekrofagiczne może być przydatna w sytuacjach:
• gdy na miejscu przestępstwa obecne są jedynie
larwy, a  zwłoki zostały stamtąd wcześniej usu­
nięte po częściowym lub całkowitym rozkładzie
(w celu uzyskania profilu genetycznego i identy­
fikacji nieznanych zwłok) [9, 10];
• gdy na zwłokach, w  przeciwieństwie do oto­
czenia, nie stwierdza się obecności owadów lub
w  pobliżu znajduje się alternatywne źródło po­
karmu (w  celu potwierdzenia lub wykluczenia
żerowania zabezpieczonych okazów na ludzkich
zwłokach, a  zatem możliwości ich dalszego wy­
korzystania w ekspertyzie; wykluczenie przypad­
kowego lub celowego naniesienia „fałszywych”
śladów entomologicznych) [11–13];
• rozkawałkowania zwłok (w  celu potwierdzenia
wspólnego pochodzenia szczątków ujawnionych
w różnych miejscach) [14].
Autorzy niniejszej pracy dokonali przeglądu opi­
sów przypadków udanej izolacji kwasów nukleino­
wych z  larw żerujących na zwłokach ludzkich oraz
odpowiednich badań eksperymentalnych dostępnych
w bazach medycznych w celu przedstawienia aktual­
nego stanu wiedzy w tym wspólnym obszarze zainte­
resowań medycyny, entomologii i genetyki sądowej.
agencies and the justice system worldwide, Poland
included [1]. The tendency can be attributed, among
other factors, to the increasing number of possible
applications of carrion insects and their remains on
the site of body discovery (the so­called entomologi­
cal evidence) in medicine, toxicology and forensic ge­
netics [2]. The current applications of carrion insects
go much beyond the traditional entomological esti­
mation of the time of death [3]. It is also worthwhile
to note that a number of new subdisciplines are also
emerging within the broader field of forensic ento­
mology, including entomotoxicology, virtual forensic
entomology, funeral archeoentomology, etc. [4–6].
One of the most recent possible applications of
entomological material is based on the gut contents
and faeces of insects (mainly blowfly larvae) that
feed on corpses as an alternative source of human
genetic material which makes it possible to analyze
both genomic and mitochondrial DNA (mtDNA)
sequences [7, 8].
A genetic analysis of food ingested by necropha­
gous insects can be useful in the following cases:
• when the site of crime only reveals the presence
of larvae, and the dead body was previously re­
moved from the scene following partial or com­
plete decomposition (to obtain the genetic profile
and identify an unknown corpse) [9, 10];
• when no insects are found on the corpse, whereas
they occur in the environment, or when there is
an alternative source of food in the vicinity (to
either confirm or rule out the fact that collect­
ed specimens have fed on a human corpse, and
hence can be used for preparing an expert opin­
ion; to exclude accidental or deliberate planting
“false” entomological evidence) [11–13];
• when the corpse is fragmented (to confirm the
common origin of remains discovered in differ­
ent locations) [14].
The authors of the present study have performed
a  review of cases in which nucleic acids were suc­
cessfully isolated from larvae feeding on cadavers,
and relevant experimental studies available in medi­
cal databases, for the purpose of presenting the cur­
rent state of knowledge in the area of common inter­
est of medicine, entomology and forensic genetics.
Przewód pokarmowy larw muchówek
Przewód pokarmowy larw muchówek rozpoczy­
na się otworem gębowym w ryjku, a kończy w ostat­
Alimentary canal of blowfly larvae
The alimentary canal of blowfly larvae begins with
the mouth located in the snout, and ends with the rec­
Archiwum Medycyny Sądowej i Kryminologii
Archives of Forensic Medicine and Criminology
255
Rafał Skowronek, Marcin Tomsia, Kornelia Droździok, Jadwiga Kabiesz
Owady żerujące na zwłokach jako alternatywne źródło ludzkiego materiału genetycznego
nim segmencie odwłoka otworem odbytowym [15].
Składa się z  trzech morfologicznie i  ontologicznie
różnych części – jelita przedniego, środkowego i tyl­
nego. W  obrębie jelita przedniego przełyk bez wy­
raźnej granicy przechodzi w wole (łac.
ingluvies,
ang.
crop),
które wypełnione u larw III stadium jest dobrze
widoczne nawet gołym okiem i  tym samym łatwe
do identyfikacji (ciemne pole wewnątrz larwy w  jej
przedniej części; ryc. 1.). Kolor i długość wola można
wykorzystać przy ocenie wieku osobnika [16].
Wole jest nieparzystym workiem, nazywanym
również zbiornikiem pokarmu albo pęcherzem
wola. Różni się od przełyku znacznie większą śred­
tum in the terminal abdominal segment [15]. It con­
sists of three morphologically and ontologically differ­
ent sections: the foregut, midgut, and hindgut. Within
the foregut, the oesophagus – without an apparent
distinction – expands into the crop (Lat.
ingluvies).
When filled, the crop can be distinctly seen in third­
instar larvae even with the naked eye, and thus easy
to identify (a dark spot inside the larva in its anterior
section; Fig. 1). The colour and length of the crop can
be used to estimate the age of larva specimens [16].
The crop is a non­paired sac, also referred to as
the food sac or the craw. It is differentiated from the
oesophagus with its much larger diameter. In blow
A
B
wole (ang.
crop)
C
jelito (ang.
intestine)
Ryc. 1.
Górny panel:
Poglądowy szkic stadiów rozwojowych larw muchówek. A) I stadium larwalne;
B) II stadium larwalne; C) III stadium larwalne (to właśnie w tym stadium można efektywnie wyizolować wole
zawierające największą ilość niestrawionego ludzkiego DNA). Na rycinie nie zachowano dokładnych pro-
porcji – istotny jest przyrost masy i długości larwy wraz z wiekiem.
Dolny panel:
Fotografia kłębowiska larw
III stadium z wypełnionymi wolami, zaznaczonymi za pomocą białych strzałek (dzięki uprzejmości prof. dr.
hab. Krzysztofa Szpili z Katedry Ekologii i Biogeografii Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu)
Fig. 1.
Upper panel:
Illustrative representation of development stages of fly larvae. A) first larval stage; B) sec-
ond larval stage; C) third larval stage (at this stage it is possible to successfully isolate crops containing the
largest amount of undigested human DNA). The figure does not reflect accurate proportions: the focus is on
the increase in weight and length of larvae along with age.
Lower panel:
Photograph of a group of third-instar
larvae with filled crops, marked by white arrows (courtesy of Prof. Krzysztof Szpila, PhD (hab.), Chair of Ecol-
ogy and Biogeography, Nicolaus Copernicus University in Toruń)
256
Archiwum Medycyny Sądowej i Kryminologii
Archives of Forensic Medicine and Criminology
Arch Med Sąd Kryminol 2014; vol. 64: 254–267
nicą. Jego umięśnienie u plujek (Calliphoridae) jest
dobrze rozwinięte. Przewód zbiornika pokarmu
leży w  tej samej płaszczyźnie co początkowa część
przełyku. Wessany przez muchówkę płynny pokarm
dostaje się do wola, a stamtąd stopniowo przechodzi
do jelita środkowego. W przypadku pobrania wraz
z płynnym pokarmem większej ilości stałych cząstek
pokarm może przechodzić dalej, omijając wole.
flies (Calliphoridae), the crop has a well­developed
musculature. The duct of the food sac lies in the
same plane as the initial section of the oesophagus.
Liquid food sucked by flies enters the crop, from
which it gradually passes into the midgut. When­
ever ingested liquid food contains a larger amount
of solid particles, the food can pass further, bypass­
ing the crop.
Prezerwacja larw i preparatyka wola
W  tabeli I  zebrano i  podsumowano wybrane
publikacje dotyczące analizy ludzkiego materia­
łu genetycznego, wyizolowanego z  larw owadów
nekrofagicznych. Większość z  nich ma charakter
typowo poznawczy (badania laboratoryjne). Po­
stacie dorosłe (imago) wybranych grup owadów,
użytecznych w  genetyce sądowej, przedstawiono
na rycinie 2.
Najczęściej wybieranym do badań stadium roz­
wojowym było III (najstarsze) stadium larwalne,
które cechuje m.in. największa długość larwy [17].
Czas, jaki musi upłynąć do osiągnięcia tego sta­
dium, jest cechą gatunkową, np. dla
Calliphora vi-
cina
wynosi 2,5–4,5 doby od momentu złożenia jaj
w sprzyjających warunkach temperaturowych.
Po wybraniu aktywnie żerujących larw zaleca się
ich uśmiercenie, przemycie w  roztworze podchlo­
rynu sodu i wodzie dejonizowanej [18]. Wykazano,
że powszechnie stosowane uśmiercenie larw przez
ich kilkusekundowe przelanie wrzątkiem, poprze­
dzające zamrożenie, nie wpływa na efekt profilowa­
nia DNA [14]. Po pozbyciu się nadmiaru wody, za
pomocą sterylnej pęsety należy przenieść larwy do
probówki i przechowywać do czasu analizy w tem­
peraturze –20
o
C lub –70
o
C. Co ważne, larwy po­
winny być zamrażane bez pozostałości wody, która
uszkadza wole, a  tym samym obniża efektywność
izolacji DNA.
Głównym źródłem treści pokarmowej larwy wy­
korzystywanej do analiz zawartego w niej ludzkiego
materiału genetycznego jest opisane powyżej wole.
Jest to miejsce przechowywania treści pokarmowej
i generalnie nie są tam wydzielane enzymy trawien­
ne. Organ ten nie jest jednak wolny od ich działania
ze względu na przedostawanie się enzymów wraz
ze śliną larwy, pochodzącą z gruczołów ślinowych,
która nadtrawia pokarm [17]. Oczywiście, im dłuż­
szy jest czas trawienia przez larwę spożytego pokar­
Preservation of larvae and preparation
of the crop
Table I  lists and summarizes selected publica­
tions discussing the analysis of human genetic ma­
terial isolated from necrophagous insect larvae. The
majority of them are typically cognitive in character
(laboratory tests). Adult stages (imago) of selected
groups of insects which are useful in forensic genet­
ics are presented in Fig. 2.
The most commonly investigated development
stage was the third (oldest) larval stage which is char­
acterized, among other features, by the largest length
of larvae [17]. The time that elapses until the stage is
achieved is species­specific – for example, for
Cal-
liphora vicina
it is 2.5–4.5 days from the moment of
egg­laying in favourable temperature conditions.
After selecting actively feeding larvae, they
should be killed, washed in sodium hypochlorite
solution and deionized water [18]. The common
practice of killing larvae by placing them for several
seconds in boiling water and then freezing has not
been shown to influence the effect of DNA profil­
ing [14]. After removing excess water, larvae should
be transferred into a test tube using sterile tweezers,
and stored until the time of analysis at a tempera­
ture of –20
o
C or –70
o
C. Importantly, larvae should
be frozen without residual water because it damages
the crop and therefore reduces the effectiveness of
DNA isolation.
The crop, as described above, is the main source
of food content collected from larvae for perform­
ing analysis of contained human genetic material.
It is where food content is stored and, generally, no
digestive enzymes are secreted. However, the organ
is not free from their activity because of the release
of enzymes together with larval saliva originat­
ing in salivary glands, which is responsible for the
preliminary digestion of food [17]. Naturally, the
longer a  larva digests ingested food, the lower the
Archiwum Medycyny Sądowej i Kryminologii
Archives of Forensic Medicine and Criminology
257
258
Gatunek
Species
Kraj
Country
Wiek
Age
Prezerwacja
Preservation
Zestaw/metoda
izolacji
Isolation kit/
method
Qiagen
TM
DNA
MicroKit, DNA
IQ
TM
(Promega),
Chelex
TM
(Biorad)
AmpFlSTR
Identifiler
TM
15/15 + Y-filer
TM
16/16
nie badano
not studied
uzyskano
fragment
HVII 3/5
HVII 3/5
fragment
was
obtained
nie
uzyskano
not obtained
70-procentowy
roztwór etanolu
w 4
o
C
70% ethanol
solution at 4
o
C
na sucho w –70
o
C
dry, at –70
o
C
–
ekstrakcja
fenolowo-
-chloroformowa
phenol-
chloroform
extraction
Identifiler
13/16
nie badano
not studied
[44]
nie badano
not studied
QIAamp®
[21]
Analiza STR
STR analysis
Analiza
mtDNA
mtDNA
analysis
Piśmiennictwo
References
Calliphora
vicina
Włochy
Italy
III stadium
larwalne
third larval
stage
III stadium
larwalne
third larval
stage
70-procentowy
roztwór etanolu
w –20
o
C
70% ethanol
solution at –20
o
C
na sucho w –20
o
C
dry, at –20
o
C
Cynomyop-
sis cadave-
rina
USA
[11]
dorosłe
(imago)
adult (imago)
Calliphori-
dae, Sarco-
phagidae
Meksyk
Mexico
–
Aldrichina
grahami
Chiny
China
III stadium
larwalne
third larval
stage
Identifiler
16/16
uzyskano
fragment
HVII
HVII
fragment
was
obtained
–
QIAamp®
Identifiler
16/16
nie badano
not studied
[14]
Aldrichina
grahami
Chiny
China
III stadium
larwalne
third larval
stage
[45]
Tabela I.
Podsumowanie doniesień dotyczących udanej izolacji i analizy ludzkiego DNA z materiału entomologicznego
Table I.
Summary of reports on the successful isolation and analysis of human DNA from entomological material
Liczba
osobników
Number of
specimens
Rozmiar
wola
Crop size
8–10
2–5 mm
5
ok. 3 mm
ca. 3 mm
5
–
Rafał Skowronek, Marcin Tomsia, Kornelia Droździok, Jadwiga Kabiesz
Insects feeding on cadavers as an alternative source of human genetic material
3
–
nie podano
not specified
nie podano
(długość larw
1,1–1,6 cm)
not specified
(length
of larvae:
1.1–1.6 cm)
Archiwum Medycyny Sądowej i Kryminologii
Archives of Forensic Medicine and Criminology
nie podano
not specified
nie podano
(długość larw
1,1–1,5 cm)
not specified
(length
of larvae:
1.1–1.5 cm)

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin