Zagadnienia.docx

Zagadnienia od P. dr. Jałosińskiej:

1.       Definicja szczepu pro biotycznego

-          Probiotyczność jest cechą szczepową!

-          Określenie probiotyk pochodzi od greckich słów „pro bios”, czyli „dla życia”, w odróżnieniu od określenia „antybiotyk”: „anty bios”, czyli „przeciw życiu”

-          Probiotyki – prozdrowotne szczepy głównie bakterii kwasu mlekowego. Najwięcej szczepów probiotycznych pochodzi z następujących rodzajów i gatunków bakterii:

- Lactobacillus

              - acidophilus

              - casei

              - paracasei

              - rhamnosus

- Bifidobacterium

              - bifidum

              - breve

Saccharomyces bulardi – wyjątek, który nie należy do bakterii mlekowych, ma działanie probiotyczne

-          Definicja probiotyków wg Schrezenmeira i de Vrese’a (2001r.)

„Probiotykiem jest preparat lub produkt zawierający wystarczającą ilość żywych, zdefiniowanych mikroorganizmów w określonej liczbie, które zmieniają mikroflorę w odpowiednich segmentach organizmu gospodarza i dzięki temu wywierają korzystny wpływ na jego zdrowie”

2.       Wymagania ze względu na bezpieczeństwo, właściwości funkcjonalne i technologiczne – w stosunku do szczepów pro biotycznych
               PODSTAWOWE KRYTERIA, JAKIE MUSZĄ SPEŁNIAĆ PROBIOTYKI ZE WZGLĘDU NA
               BEZPIECZEŃSTWO

-          Pochodzenie od ludzi, czyli szczep pro biotyczny musi być wyizolowany z przewodu pokarmowego zdrowego, przebadanego człowieka. Najczęściej izoluje się Lactobacillus, natomiast Bifidobacterium izoluje się z noworodków

-          Izolowane z przewodu pokarmowego zdrowych osobników

-          Historia bezpiecznego stosowania

-          Brak informacji o powiązaniu z chorobami infekcyjnymi serca lub przewodu pokarmowego.

-          Brak zdolności rozszczepiania kwasów żółciowych

-          Brak genów odporności na antybiotyki zlokalizowanych na elementach niestabilnych (plazmidy)

-          Plazmidy są to pozachromosomalne czynniki dziedziczności, krótkie fragmenty DNA, które podobnie jak chromosom bakteryjny niosą informacje genetyczne. Informacje niesione na plazmidach mogą być bardzo łatwo przekazane z jednej komórki na drugą, często nawet zachodzi to między komórkami niespokrewnionymi, w procesie koniugacji. Przekazanie plazmidu wraz z genami odpowiedzialnymi za różne funkcje – geny oporności na antybiotyki mogłyby być przekazane bakteriom znajdującym się w środowisku. Dlatego szczepy probiotyczne nie mogą nieść takich genów na plazmidach, aby ich nie przekazać patogenom obecnym w przewodzie pokarmowym.

FUNKCJONALNOŚĆ

-          Konkurencyjność w stosunku do mikroflory zasiedlającej ekosystem jelitowy (konkurencja o receptory, o miejsce adhezji w nabłonku przewodu pokarmowego. Warunkiem działania patogenu jest zajęcie miejsca receptorowego, dlatego zajęcie ich przez korzystną mikroflorę zapobiega zatruciom, biegunkom itp.)

-          Aktywność antagonistyczna w stosunku do patogenów, takich jak: Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, Clostridium difficile (rzekomo błoniaste zapalenie jelit)

-          Zdolność do przeżycia, wzrostu i aktywności metabolicznej w miejscu przeznaczenia, aczkolwiek wymaga się zdolności do adhezji i kolonizacji nabłonka

-          Odporność na sole żółci

-          Odporność na kwasowość soku żołądkowego (bakteria może wówczas dotrzeć w stanie niezmienionym do dolnych odcinków przewodu pokarmowego (odbytnica), aby ujawnić swoje prozdrowotne właściwości. Dlatego najpierw sprawdza się te dwie właściwości podczas selekcji szczepów

-          Odporność na bakteriocyny, kwasy i inne związki antagonistyczne produkowane przez endogenną mikroflorę zasiedlającą ekosystem jelitowy

-          Zdolność trwałego przylegania (adhezji) do nabłonka i kolonizacji określonych miejsc w organizmie człowieka lub odpowiednio długi czas przeżycia

PRZYDATNOŚĆ TECHNOLOGICZNA

Łatwość produkcji dużej ilości biomasy, wysoka produktywność hodowli

-          Odporność na procedury utrwalania starterów (zamrażanie, liofilizacja, przechowywanie)

-          Żywotność i stabilność pożądanych cech bakterii w czasie przechowywania i dystrybucji produktów probiotycznych

-          Wysoka przeżywalność przechowalnicza bakterii w gotowym produkcie (wymaga się obecności bakterii w fazie wzrostu stacjonarnego, nie w fazie zamierania)

-          Zapewnienie pożądanych cech sensorycznych gotowych produktów (szczepy pro biotyczne o niekorzystnych cechach sensorycznych łączy się z inną)

-          Odporność na bakteriofagi (wirusy bakteryjne, są dużym problemem w przemyśle mleczarskim, gdzie bardzo szybko mogą powodować zinaktywowanie zakwasów)

-          Genetyczna stabilność

3.       Właściwości prozdrowotne szczepów pro biotycznych

-          Aktywność antagonistyczna w stosunku do patogenów takich jak Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori

-          Ochrona przed biegunkami po antybiotykoterapii

-          Utrzymywanie w równowadze mikroflory jelitowej

-          Działanie hamujące na rozwój bakterii gnilnych i procesów gnilnych w jelitach, zapobiegające zaparciom i schorzeniom geriatrycznym
 

4.       Dobór drobnoustrojów do procesów biotechnologicznych oraz prowadzenie czystych kultur (w tym metody otrzymywania czystych kultur),
DOBÓR DROBNOUSTROJÓW ORAZ PROWADZENIE CZYSTYCH KULTUR (STABILIZACJA TECHNOLOGICZNYCH CECH MIKROORGANIZMÓW)

-          Czynnik biologiczny (organizm, komórka, tkanka itp.) jest głównym ogniwem całego procesu biotechnologicznego. Przy zachowaniu prawidłowych warunków rozwoju zapewnia on uzyskanie pożądanego, o odpowiedniej jakości produktu. Dobór organizmów jest uwarunkowany wiedzą i doświadczeniem. W tym zakresie obserwuje się dążenie do maksymalizacji określonej właściwości czynnika biologicznego m.in. przez zastosowanie metod inżynierii genetycznej. Istnieją też wyspecjalizowane firmy prowadzące tzw banki drobnoustrojów, dysponujące dokładną charakterystyką posiadanych szczepów.

-          Stabilizacja cech genetycznych, fizjologicznych, morfologicznych i technologicznych jest podstawowym wymogiem praktyki biotechnologicznej, szczególnie przy kosztownej produkcji z użyciem drogich składników i w dużej ilości, gdyż wymienione składniki rzutują na efektywność ekonomiczną przedsięwzięcia. Dotyczy to szczególnie organizmów zmodyfikowanych genetycznie, gdyż nakłady finansowe na otrzymanie rekombinantu (hybrydomu) o pożądanych cechach są znaczne, a stabilność genetyczna organizmu – labilna. Zachowanie wymienionych wyżej cech jest sprawą indywidualną każdego organizmu i wymaga w każdym przypadku odrębnego traktowania.

-          Przy operacjach zamrażania i rozmrażania, w zależności od warunków procesu, może dochodzić do zabicia ok. 90-95% drobnoustrojów. Jest to wykorzystywane do destrukcji komórek przy otrzymywaniu składników endogennych. Zazwyczaj stosuje się

-          Przechowywanie organizmów w pożywce lub na podłożu stałym w niskiej temperaturze (2-6oC), metoda ta wymaga częstego przeszczepiania (raz na 8-16 tyg) oraz charakteryzuje się dużym zagrożeniem (zakażenia, mutacje)

-          Przechowywanie w stanie zamrożenia od -18 do -80oC lub w ciekłym azocie, tj w temperaturze -196oC, rozwiązanie to umożliwia przechowywanie kultur przez kilka lat;

-          Liofilizację po uprzednim zawieszeniu w odpowiednich roztworach zawierających czynniki ochronne – krioprotektanty (sacharozę, odtłuszczone mleko w proszku), proces liofilizacji umożliwia przechowywanie kultur w hermetycznych ampułach przez wiele lat.

METODY OTRZYMYWANIA CZYSTYCH KULTUR

-          Metoda rozcieńczeń Listera (1878r.), a następnie metoda płytkowa Kocha (metoda posiewu redukcyjnego,metoda posiewu powierzchniowego, metoda wgłębna, czyli płytek lanych)

-          Metoda kropelkowa Lindnera (stosowana głównie w przypadku czystych kultur drożdży i grzybów strzępkowych)

-          Metoda tuszowa (stosowana w przypadku czystych kultur bakterii)

-          Metoda izolowania czystych kultur z zastosowaniem mikromanipulatora (zalecana w badaniach naukowych)

-          Pomocnicze metody wyodrębniania czystych kultur, bazujące na wykorzystaniu różnic fizjologicznych i biochemicznych drobnoustrojów
 

5.       Produkcja szczepionek przemysłowych; przechowywanie kultur macierzystych; przygotowanie inokulum i zaszczepianie do produkcji.

PRODUKCJA SZCZEPIONEK PRZEMYSŁOWYCH POLEGA NA:

-          Namnożeniu szczepów składowych w optymalnych środowiskach hodowlanych

-          Uzyskaniu dużej liczby komórek w stanie pełnej aktywności biochemicznej

-          Standaryzacji składu gatunkowego, tj zestawieniu właściwych proporcji gatunków czy szczepów stanowiących o przydatności szczepionki w warunkach produkcyjnych (podczas konstrukcji szczepionek wieloskładnikowych)

-          Zabezpieczeniu żywotności komórek i ich właściwości biochemicznych poprzez odpowiednie utrwalenie szczepionki
 

PRZECHOWYWANIE KULTURY MACIERZYSTEJ W BANKACH KULTUR:

-          Przechowywanie mikroorganizmów w pożywce lub na podłożu stałym w niskiej temperaturze (2-6oC). Metoda ta wymaga jednak częstego przeszczepiania (raz na 8-16 tygodni) oraz charakteryzuje się dużym zagrożeniem (zakażenia, mutacje)

-          Suszenie à w temperaturze pokojowej pod normalnym ciśnieniem; à pod zmniejszonym ciśnieniem w obecności czynnika pochłaniającego wodę (np. P2O5); à na drodze sublimacji ze stanu głębokiego zamrożenia. Na przykład suszenie hodowli bezpośrednio na podłożu wzrostowym (grzyby strzępkowe i promieniowce)

-          Zamrożenie (1oC/min lub lepiej szybciej) oraz przechowywanie kultury macierzystej w stanie zamrożonym (od -18oC do -80oC) lub w ciekłym azocie (w temperaturze -196oC). Stosuje się tu substancje ochronne, takie jak: serwatka, bulion, mleko, pepton, żelatyna, surowica krwi, węglowodany w postaci roztworów glukozy, sacharozy, laktozy i dekstranu, roztwory aminokwasów, jak kwas asparaginowy, glicerol. Ten sposób umożliwia przechowywanie kultur przez kilka lat. (pobiera się z początku fazy stacjonarnej)

-          Liofilizację (oziębienie i zamrożenie zawiesiny komórek w temperaturze -70oC, a następnie wysuszenie jej w wysokiej próżni) bezpośrednio w podłożu hodowlanym lub po uprzednim zawieszeniu w odpowiednich roztworach zawierających czynniki ochronne – krioprotektanty (sacharozę, odtłuszczone mleko w proszku, glicerol, surowicę końską). Proces liofilizacji umożliwia przechowywanie kultur w hermetycznych ampułkach przez wiele lat

-          Rozmrożenie (1oC/min, najlepiej w łaźni wodnej o temperaturze 40oC) lub uwodnienie kultury (zaszczepu) macierzystej

-          Przygotowanie zaszczepu roboczego (ożywianie zaszczepu macierzystego)

-          I etap: hodowla na skosach lub płytkach Petriego, tzn namnażanie na podłożu stałym

-          II etap: przeniesienie kultury z podłoża stałego na pożywkę płynną przez dokonanie zmywania lub przeniesienie „kłaczka”

-          III etap: przeniesienie kultur namnożonych na pożywkach płynnych (zaszczepu macierzystego) do większej objętości pożywki à zaszczep roboczy (butelki „Roux”, kolby stożkowe)

-          Przetrzymywanie zaszczepu roboczego w optymalnych warunkach stacjonarnych, okresowo mieszając lub ciągle wytrząsając przy użyciu wytrząsarek (w zależności od wymogów kultury drobnoustrojów) à zaszczep roboczy pierwszy

-          Zaszczep roboczy drugi i dalsze w wyniku kolejnych pasaży

-          Czasami przed kolejnym pasażem lub zaszczepieniem do produkcji stosuje się regenerację (aktywację kultury, np.

-          W przypadku drożdży hodowlanych: silne zakwaszenie środowiska

-          W przypadku grzybów pleśniowych: przeztrzymywanie grzybni w formie wegetatywnej przez pewien czas w warunkach, które nie sprzyjają rozwojowi, np. w niskiej temperaturze

-          W przypadku przygotowywania zakwasów mleczarskich (na przykładzie mikroflory zakwasu do ukwaszania śmietanki): 2-3 krotne rozcieńczenie zaszczepu świeżo spasteryzowanym, schłodzonym mlekiem odtłuszczonym i przetrzymywanie przez 1 godzinę w temperaturze 26-30oC

-          Zaszczepienie do produkcji
 

PRZYGOTOWANIE I WPROWADZANIE INOKULUM

-          Drobnoustroje wprowadza się do pożywki w postaci kultury macierzystej, w warunkach chroniących je przed zakażeniem. Odbywa się to przez dodanie aktywnego (w wykładniczej (logarytmicznej) fazie wzrostu) inokulum...