1. Kwasy nukleinowe
§ Monomer kwasu nukleinowego - nukleotyd - składa się z nukleozydu czyli cząsteczki pentozy (dla RNA rybozy, dla DNA deoksyrybozy) do której przyłączona jest, przy pierwszym atomie węgla, wiązaniem N-glikozydowym zasada azotowa (purynowa lub pirymidynowa) oraz z reszty fosforanowej, przyłączonej do trzeciego oraz piątego atomu węgla dwóch sąsiednich pentoz polimeru. Czyli między nukleotydami występuje wiązanie fosfodiestrowe.
§ Zasadami są adenina, guanina, cytozyna oraz uracyl (w RNA) lub tymina (w DNA).
§ Kwasy nukleinowe przechowują informację genetyczną organizmu oraz pośredniczą w produkcji białek zgodnie z zasadami kodu genetycznego. Mogą też pełnić funkcję enzymów. Określane są wtedy jako rybozymy.
§ Cząsteczki kwasu rybonukleinowego pełnią kluczowe role w funkcjonowaniu komórki. Odpowiadają m.in. za regulację ekspresji genów (miRNA), a także wchodzą w skład aparatu translacyjnego (rRNA tworzące rybosom oraz tRNA dobudowujące kolejne aminokwasy do syntezowanego łańcucha peptydowego). Spośród innych funkcji realizowanych przez RNA można wymienić regulację splicingu przez snRNA oraz ochronę komórek płciowych przed retrotranspozonami przez piRNA
2. Od DNA do białka (transkrypcja i translacja) w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych.
TRANSKRYPCJA – proces gdzie powstaje RNA (kopia sekwencji DNA), pierwszy etap ekspresji genów, działają polimerazy RNA. RNA powstaje na nici matrycowej i ma sekwencję nie matrycowej (sensownej, kodującej)
U prokariotów 3 etapy, jedna polimeraza zbudowana z kilku podjednostek (holoenzym, gdy oddysocjowuje część sigma wtedy rdzeń enzymu.
§ Inicjacja – miejsce startu to początek genu, sygnały do zainicjowania zawarte w sekwencji zasad promotora (specyficzne sekwencje nukleotydów działające jako miejsca przyłączenia polimerazy RNA. Polimeraza rozpoznaje sekwencje -35 i -10 promotora) za rozpoznawanie i wiązanie polimerazy odpowiada podjednostka sigma, przy jej braku wiązanie ma charakter przypadkowy. Po związaniu ssię enzymu z promotorem powstaje zamknięty kompleks promotorowy (DNA dwuniciowa helisa), otwarty kompleks promotorowy (DNA dwuniciowa helisa ulega dysocjacji). Podjednostka sigma oddysocjowuje do kompleksu tworząc rdzeń enzymu, 2 pierwsze rybonukleotydy wiążą się z DNA
§ Elongacja – polimeraza przesuwa się wzdłuż cząsteczki DNA. Najpierw transkrypcji ulega sekwencja liderowa, potem sekwencja kodująca na końcu niekodująca ekwencja końca 3’
§ Terminacja – zachodzi przy sekwencjach palindromowych. Etap elongacji kończy się, gdy polimeraza RNA dotrze do terminatora - sekwencji kończącej, wyznaczającej miejsce terminacji (zakończenia) transkrypcji. Sekwencja taka tworzy strukturę szpilki do włosów (hairpin), która zatrzymuje polimerazę RNA, co powoduje rozpad kompleksu enzym - DNA - RNA. Drugim mechanizmem terminacji wykorzystywanym przez bakterie jest terminacja rho-zależna, gdzie do terminacji transkrypcji potrzebne jest działanie czynnika rho (ρ). Transkrypt prokariotyczny nie wymaga dalszej obróbki, a translacja rozpoczyna się, zanim transkrypcja dobiegnie końca.
U eukariotów podobnie inicjacja bardziej skomplikowana, terminacja nie polega na tworzeniu spinki terminacyjnej, transktypcję katalizują 3 enzymy (polimeraza RNA I, II, III)
§ W przeciwieństwie do polimerazy RNA bakterii, jądrowe polimerazy RNA organizmów eukariotycznych potrzebują do rozpoczęcia transkrypcji zestawu właściwych dla danej polimerazy podstawowych czynników transkrypcyjnych, ponieważ rozpoznają nie sekwencję promotora, ale kompleks kwas nukleinowy-białko. Sterowanie transkrypcją - przez związanie czynników białkowych czy hormonalnych - może odbywać się z różnych miejsc na DNA. Miejsca te mogą leżeć w obrębie genów (promotory), lub też w odległości kilku tysięcy nukleotydów (enhancery, silencery).
§ Pierwszym etapem transkrypcji jest powstanie kompleksu preinicjacyjnego (PIC) składającego się z ogólnych czynników transkrypcyjnych, który wiąże się z sekwencją promotora. Na dostępność miejsc wiązania się czynników transkrypcyjnych wpływa struktura (upakowanie) chromatyny. Wiele promotorów genów transkrybowanych przez jądrową polimerazę RNA II zawiera sekwencję TATA (ang. TATA box) położoną ok. 25 par zasad przed miejscem rozpoczęcia transkrypcji. Sekwencja ta jest rozpoznawana przez białko TBP (ang. TATA-box binding protein), które staje się zalążkiem kompleksu preinicjacyjnego. Drugą sekwencją rozpoznawaną przez ogólne czynniki transkrypcyjne jest sekwencja otaczająca miejsce startu transkrypcji (+1). Polimeraza RNA II wiąże się do kompleksu preinicjacyjnego i rozpoczyna transkrypcję. Do inicjacji transkrypcji przez polimerazę RNA II in vivo konieczny jest też kompleks białkowy zwany Mediatorem. W regulacji transkrypcji u eukariontów mogą brać udział także inne czynniki transkrypcyjne wiążące się z sekwencjami enhancerów i silencerów, często położone w znacznej odległości od miejsca inicjacji transkrypcji. Do rozpoczęcia transkrypcji przez polimerazę RNA I i III potrzebne są inne sekwencje oraz zestaw ogólnych czynników transkrypcyjnych specyficznych dla tych polimeraz.
§ Następny etap transkrypcji to elongacja. Polimeraza RNA przesuwa się dalej, a ogólne czynniki transkrypcyjne są uwalniane.
§ Terminacja transkrypcji nie wymaga białek uwalniających, a jej sygnały są inne, niż u prokariontów. Zaproponowano dwa modele terminacji transkrypcji u eukariotów. Według pierwszego po transkrypcji miejsca poliadenylacji w polimerazie zachodzi zmiana konformacji, która ułatwia terminację transkrypcji. Według drugiego modelu w terminacji transkrypcji bierze udział trawiąca RNA egzonukleaza, która przecina cząsteczkę mRNA, a następnie niszczy ten fragment RNA, który ciągle jest związany z polimerazą. Transkrypt jest komplementarny do nici matrycowej i homologiczny z nicią kodującą.
TRANSLACJA
W aktywacji właściwy aminokwas jest dołączany do właściwego tRNA za pomocą wiązania estrowego, powstałego przez reakcję grupy karboksylowej aminokwasu i grupy OH przy końcu 3' tRNA. Taki zespół określa się mianem aminoacylo-tRNA.
§ Inicjacja translacji ma miejsce, kiedy mała podjednostka rybosomu przyłącza się do końca 5' mRNA. Do małej podjednostki przyłącza się duża podjednostka rybosomu. Na podjednostce 50s uaktywniają się dwa miejsca: P - miejsce peptydowe i A - miejsce akceptorowe. Pierwszy aminoacylo-tRNA ustawia się w miejscu P.
§ Elongacja ma miejsce, kiedy następny aminoacylo-tRNA przyłącza się do rybosomu w miejscu A. Następnie proces translacji zachodzi na zasadzie komplementarności kodonu mRNA z antykodonem na tRNA. Rybosom i tRNA są tak ukształtowane, aby dwa aminokwasy, przyłączone do tRNA zajmujące w rybosomie miejsca A i P znajdowały się blisko siebie. Dzięki temu zachodzi reakcja między grupą aminową i karboksylową - dwa aminokwasy łączą się. Ten proces - tworzenie wiązań peptydowych jest katalizowany przez peptydylotransferazę - rybozym (rRNA) wchodzący w skład rybosomu. Po syntezie, tRNA szybko zwalnia miejsce P i wraca do cytoplazmy, z kolei aminoacylo-tRNA ulega przesunięciu z miejsca A na miejsce P. Proces ten nazywamy translokacją. Jednocześnie przesuwa się także mRNA. Wielkość tego przesunięcia wynosi zawsze trzy nukleotydy. Na miejsce A nasuwa się nowy tRNA zawierający antykodon odpowiadający kolejnemu kodonowi na mRNA. Proces elongacji powtarza się aż do napotkania przez podjednostkę mniejszą rybosomu w miejscu A kodonu stop (UAA, UAG lub UGA).
§ W tym momencie następuje terminacja translacji. Łańcuch polipeptydowy zostaje uwolniony do cytoplazmy, tRNA zostaje oddzielone od mRNA, a rybosom rozpada się na podjednostki, które mogą zostać ponownie wykorzystane do inicjacji translacji kolejnego mRNA.
U prokariontów inicjacja translacji wymaga małej i dużej podjednostki rybosomu, czynników inicjacji translacji, GTP jako źródła energii, oraz inicjatorowego aminoacylo-tRNA (ze związanym aminokwasem formylometioniną). Mała podjednostka rybosomu wiąże się z czynnikiem inicjacji translacji IF3. 16S rRNA z małej podjednostki rybosomu 30S rozpoznaje i wiąże komplementarną sekwencję Shine-Dalgarno w mRNA. Czynnik inicjacji translacji IF2 wiąże się z fMet-tRNA i pomaga mu związać się z małą podjednostką rybosomu. W rybosomie są trzy miejsca, w których może znajdować się tRNA: miejsce A, przez które wchodzi aminoacylo-tRNA (z wyjątkiem pierwszego aminoacylo-tRNA - fMet-tRNA, które wchodzi przez miejsce P), miejsce P, gdzie tworzy się peptydylo-tRNA, oraz miejsce E, przez które tRNA opuszcza rybosom po oddaniu aminokwasu. Aminoacylo-tRNA (fMet-tRNA) znajdujące się w miejscu P rybosomu rozpoznaje kodon inicjujący AUG. Inicjacja kończy się przyłączeniem dużej podjednostki rybosomu i uwolnieniem czynników inicjacji translacji.
Po wejściu fMet-tRNA do miejsca P miejsce A otwiera się i umożliwia związanie się kolejnego aminoacylo-tRNA. W tym wiązaniu bierze udział czynnik elongacji translacji EF-Tu. W ten sposób rozpoczyna się elongacja. Rosnący polipeptyd odłącza się od tRNA w miejscu P, a między ostatnim aminokwasem a aminokwasem przyłączonym do tRNA w miejscu A tworzy się wiązanie peptydowe. Reakcja ta jest katalizowana przez rybozym peptydylotransferazę - 23S rRNA w podjednostce 50S rybosomu. Rybosom przesuwa się o trzy nukleotydy na nici mRNA, z którą są związane tRNA. Dzięki temu polipeptyd przesuwa się z miejsca A do miejsca P, a nienaładowane tRNA trafia do miejsca E. Powstające białko wysuwa się z rybosomu przez otwór w dużej podjednostce. Elongacja trwa, dopóki rybosom nie natrafi na jeden z kodonów STOP w mRNA. Kiedy kodon STOP znajdzie się w miejscu A rybosomu, następuje terminacja translacji.
U eukariontów inicjacja translacji może przebiegać na dwa sposoby.
§ Pierwszy z nich to inicjacja zależna od czapeczki. Złożony z czynników inicjacji translacji eIF-4E, eIF4G i eIF4A kompleks eIF4F wiąże się z czapeczką i z białkiem PABP wiążącym ogon poli-A. Mała podjednostka rybosomu 40S wiąże eIF1, eIF3, eIF5 i kompleks eIF2-GTP-Met-tRNAi. Następnie eIF3 wchodzi w interakcje z eIF4G związanym z czapeczką. Taki kompleks inicjacyjny zaczyna przesuwać się wzdłuż cząsteczki mRNA w kierunku od 5' do 3', aż natrafi na kodon start AUG. Wtedy następuje uwolnienie niektórych czynników i związanie się dużej podjednostki rybosomu 60S z małą. Powstaje funkcjonalny rybosom i rozpoczyna się elongacja.
§ Inicjacja niezależna od czapeczki u eukariotów nie wymaga wędrówki rybosomu od czapeczki do kodonu start. Czynniki ITAF umożliwiają małej podjednostce rybosomu 40S związanie się z sekwencją IRES (ang. internal ribosome entry site - wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu). Sekwencje IRES występują m.in. w genach ulegających ekspresji pod wpływem czynników stresowych. Można je znaleźć także u wirusów.
3. Kod genetyczny
Kod genetyczny – zespół reguł w oparciu o które sekwencje nukleotydów w DNA są przepisywane na sekwencje nukleotydów w mRNA, a następnie na sekwencje aminokwasów w białku. Każdy kodon jest przedstawiony jako jego mRNA, więc odpowiadający mu kodon jest komplementarny.
Cechy kodu:
4. Mutacje genowe
Mutacje to zmiany sekwencji DNA organizmu spowodowane działaniem czynników fizycznych, chemicznych lub błędami w replikacji DNA, mogą być korzystne lub niekorzystne.
Dzielimy na:
· Większe
ü Delecja – utrata jednej lub kilku par nukleotydów
ü Insercja – wstawienie jednej lub kilku dodatkowych par nukleotydów
· Na odcinku mniejszym
ü Substytucja – wymiana zasady azotowej na inną
§ Tranzycja - puryna na purynę, pirymidyna na pirymidyną
§ Transwersja – pirymidynowa na purynową i odwrotnie
Skutki mutacji:
· Mutacje synonimiczne – zastąpienie prawidłowego nukleotydu innym powoduje powstanie kodonu kodującego ten sam aminokwas
· Mutacje nonsensowe – kodon sensowny zostaje zmieniony na kodon niekodujący żadnego aminokwasu, biosynteza kończy się przedwcześnie i powstaje tylko fragment łańcucha
· Mutacje typu zmiany sensu – trójka nukleotydów kodująca dany aminokwas zostaje zmieniona tak że koduje inny aminokwas = zmiana składu aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym.
· Mutacje przesunięcia fazy (ramki) odczytu – wymiana lub utrata określonej liczby par nukleotydów ale zawsze niepodzielnej prze 3 co powoduje niezgodne z pierwotną fazą odczytywanie kodonów w procesie translacji = zmiana znaczenia wszystkich trójek
5. Czynniki mutagenne (fizyczne, chemiczne i biologiczne uszkadzające DNA)
Fizyczne
§ Promieniowanie jonizujące (X, gamma) – zaburzenia procesów wewnątrzkomórkowych, zmiana struktury niektórych związków, najbardziej wrażliwe cząsteczki DNA
§ Promieniowanie UV – stymuluje tworzenie wiązań pomiędzy sąsiednimi pirymidynami i tworzenie???
§ Wysoka temperatura – obniżenie jakości pracy enzymów, powstanie miejsc apurynowych w DNA, powodujące mutacje punktowe.
Chemiczne
§ HNO2 – modyfikuje budowę niektórych zasad (usuwanie grup aminowych)
§ Analogi zasad azotowych – powodują błędy w odczycie na matrycy DNA
§ Barwniki akrydynowe – insercja lub delecja nukleotydów
§ H2O2 i NH3 – reagują z cząsteczkami DNA
§ Kolchicyna – hamuje powstawanie wrzeciona podziałowego (nieprawidłowe rozchodzenie się chromosomów w czasie podziału)
§ Sole metali ciężkich
§ Benzopiren – wsuwa się między zasady azotowe powodując komplikację w replikacji DNA
§ Iperyt – modyfikuje zasady azotowe (dołączanie grup alkilowych, np. oranż akrylowy)
...
jiso