Metody immunoenzymatyczne są zbliżone do metod radioimmunologicznych, lecz zamiast znacznika izotopowego stosuję się aktywny enzym, np. peroksydazę chrzanową( substratem może być orto- fenylenodwuamina) i alkaliczną fosfatazę ( para- nitrofenylofosforan). Aktywność enzymu mierzy się przez fotometryczne określenie natężenia koloru zmienionego przez enzym substratu. W metodzie tej stosuje się zwykle płytki plastykowe jako fazę stałą (nośnik). Pozwala to na automatyczne rozlewanie składników, rozcieńczenie i przemywanie, a także stosowanie zautomatyzowanych czytników spektrofotometrycznych. Dzięki tej metodzie można określić zarówno antygen, jak i przeciwciała, dlatego znalazła ona szerokie zastosowanie do oceny obecności antygenów i przeciwciał w chorobach zakaźnych, np. zakażeniach HIV, chorobach alergicznych, pasożytniczych, do wykrywania antygenów nowotworowych, autoantygenów oraz do oznaczania autoprzeciwciał. Istotna jest konieczność każdorazowego ustalania granicy dodatniej dla danego autoprzeciwciała na podstawie badania dużych liczebnie populacji zdrowych dawców.
Wykonanie testu polega na wprowadzeniu materiału biologicznego zawierającego przeciwciała specyficzne dla unieruchomionego antygenu. Przeciwciała te powinny być uprzednio połączone wiązaniem kowalencyjnym z enzymem. Unieruchomiony antygen i specyficzne przeciwciało tworzą kompleks immunologiczny, dzięki któremu przeciwciało zostaje trwale związane z podłożem. Po przepłukaniu środowiska reakcji i dodaniu odpowiedniego substratu, enzym związany ze specyficznym przeciwciałem katalizuje reakcję, której produkt (najczęściej barwny) można oznaczyć spektrofotometrycznie.
Jeśli absorbancja próbki jest wyższa od granicy dodatniej, próbka jest pozytywna, czyli zawiera przeciwciała. Wynik jest pozytywny wówczas, gdy stosunek między OD próbki do surowicy CUT-off wynosi więcej niż 1,1. Wynik negatywny jest wtedy, gdy proporcja ta jest mniejsza niż 0,9. Wynik wątpliwy mieści się między tymi granicami.
Rodzaje Testu ELISA
"Sandwich" ELISA – test podwójnego wiązania
Ten rodzaj testu immunoenzymatycznego służy zwykle do określania stężenia danego białka (antygenu) w badanej próbce. "kanapkowa" ELISA bierze się stąd, że antygen wiązany jest pomiędzy dwiema "warstwami" przeciwciał, co najlepiej można prześledzić, obserwując przebieg tej metody.
"Sandwich" ELISA. (1) Płytka jest pokrywana przeciwciałami specyficznymi; (2) dodawana jest próbka, i jeśli jest obecny antygen, wiąże się on do specyficznych przeciwciał; (3) antygen jest wyodrębiony z mieszaniny, po czym dodaje się przeciwciała wykrywające; (4) oraz drugorzędowe przeciwciała wyznakowane enzymem i wiążące przeciwciała wykrywające; (5) dodawany jest substrat, który jest konwertowany do wykrywalnej formy przez enzym na przeciwciałach drugorzędowych.
Pierwszym krokiem jest umieszczenie specyficznego względem danego antygenu przeciwciała na fazie stałej, np. płytce. Po wypłukaniu przeciwciał, które nie związały się z płytką, można dodać badany materiał. Jak nietrudno zauważyć, jeśli w owym materiale znajduje się poszukiwane białko, będzie się ono łączyć do przeciwciał związanych z płytką. Widać tutaj, jak ważna jest specyficzność przeciwciała, od niej bowiem zależy, czy dany antygen zostanie związany i czy nie nastąpi sfałszowanie testu w wyniku związania innych, podobnych białek.
Po dodaniu badanego materiału płytkę znowu się przepłukuje. Teoretycznie więc na płytce powinny pozostać jedynie przeciwciała, a jeżeli badany antygen był obecny – do niektórych przynajmniej przeciwciał powinien być przyłączony antygen.
W tej chwili antygen jest już wyodrębniony z mieszaniny, dzięki użyciu specyficznego przeciwciała, jednak osoba przeprowadzająca badanie nie jest jeszcze w stanie stwierdzić, czy tak się rzeczywiście stało. W tym celu dodawane jest kolejne przeciwciało, tym razem wyznakowane enzymem. Przeciwciało to również jest specyficzne względem poszukiwanego antygenu, jednak rozpoznaje inny region cząsteczki białkowej – dzięki temu przeciwciało użyte do wychwycenia antygenu nie blokuje przeciwciała znakowanego enzymem. Po przepłukaniu uzyskujemy strukturę "kanapki" (sandwicha), antygen rzeczywiście znajduje się pomiędzy dwiema warstwami przeciwciał. Teraz można dodać już substrat dla enzymu związanego z przeciwciałem . Zwykle stosuje się związki, które w wyniku reakcji enzymatycznej przechodzą w barwny produkt. Taki test ELISA jest więc także metodą kolorymetryczną. Najczęściej stosowane enzymy to fosfataza alkaliczna (substrat: fosforan p-nitrofenolu), peroksydaza chrzanowa(substrat: tetrametylobenzydyna) oraz oksydaza glukozowa (substrat: kwas 5-aminosalicylowy). Stosując spektrofotometr można więc precyzyjnie określić natężenie barwy po określonym czasie trwania reakcji, dzięki czemu można również określić stężenie antygenu w materiale użytym do badań.
TEST BEZPOŚREDNI I POŚREDNI ELISA
2 .W przypadku pośredniego testu ELISA przeciwciało monoklonalne rozpoznające swoiście antygen (przeciwciało pierwszorzędowe) nie jest znakowane. Znakowane jest natomiast przeciwciało drugorzędowe przyłączające się do przeciwciała pierwszorzędowego, rozpoznające dany izotyp immunoglobulin.
1. Bezpośredni test ELISA tzn. wykrywanie go za pomocą jednego tylko przeciwciała. test bezpośredni wymaga obecności swoistego przeciwciała, które dodatkowo musi być wyznakowane enzymem. Zatem do wykrycia innego antygenu trzeba przygotować kolejną porcję znakowanych swoistych przeciwciał, co jest kosztowne i nie zawsze możliwe do wykonania. Tych wad nie posiada test pośredni, jest on jednak bardziej pracochłonny.
Wykrywanie swoistych przeciwciał testem ELISA
Wspomniany już test podwójnego wiązania służy do wykrywania danego antygenu za pomocą przeciwciał. Sytuację można jednak odwrócić i wykryć przeciwciało za pomocą danego antygenu, co ma duże znaczenie w diagnostyce (np. wykrywanie przeciwciał anty-HIV w przypadku badań na obecność tego wirusa w organizmie chorego). W odróżnieniu jednak od testu podwójnego wiązania, wykrywanie przeciwciał można wykonać jedynie testem pośrednim.
Wykrycie przeciwciał metodą ELISA
W celu wykrycia przeciwciał należy opłaszczyć fazę stałą antygenem (1), przeciwko któremu skierowane są poszukiwane przeciwciała. W przypadku zastosowań diagnostycznych dostępne są zwykle gotowe, opłaszczone antygenem płytki. Na tak przygotowane podłoże nanosi się surowicę pacjenta i po odpowiednim czasie inkubacji płytkę się przepłukuje. Jeżeli przeciwciała skierowane przeciwko antygenowi znajdowały się w surowicy, zwiążą się one z antygenem na płytce (2). Za pomocą drugiego przeciwciała lub innego wyznakowanego ligandu można nie tylko wykryć przeciwciała, ale nawet określić ich klasę (3,4), co może dostarczyć dodatkowych informacji o chorobie lub danych epidemiologicznych (np. obecność tylko przeciwciał IgM świadczy o tym, że chory przechodzi pierwsze w życiu zakażenie danym drobnoustrojem, zaś obecność IgG świadczy o kolejnym zakażeniu)
buniagumis