Ćwiczenie 2
Właściwości fizykochemiczne białek
Cel ćwiczenia
Zapoznanie się z niektórymi właściwościami białek, m.in. ich zdolnością do wytrącania się z roztworu pod wpływem różnych czynników oraz wyznaczania punktu izoelektrycznego pI białka.
Wprowadzenie
Białka są zbudowane z α-L-aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi w łańcuchy polipeptydowe.
Rys. 1. (a) Tworzenie wiązania peptydowego, (b) struktury rezonansowe wiązania peptydowego, (c) grupy peptydowe w obrębie polipeptydu
Liczba, kolejność i rodzaj aminokwasów w cząsteczce białka jest uwarunkowana genetycznie i nosi nazwę struktury pierwszorzędowej.
Rys.2. Struktura pierwszorzędowa. (Sekwencja aminokwasowa insuliny wołowej)
Skręty łańcucha polipeptydowego oraz połączenia pomiędzy łańcuchami polipeptydowymi w cząsteczce białka (struktura wtórna- II – IV rzędowa) są utrzymywane przez wiązania kowalencyjne (wiązania dwusiarczkowe, estrowe), wiązania wodorowe, jonowe, oddziaływania hydrofobowe i słabe wiązania van der Waalsa. Pod pojęciem struktury drugorzędowej rozumiemy sposób i stopień skręcenia lub pofałdowania łańcucha polipeptydowego. Wyróżniamy tu strukturę helisy α (śrubową) oraz strukturą fałdową. Obie te struktury stabilizują wiązania wodorowe.
(a)
(b)
Rys.3. Struktury drugorzędowe. (a) Struktura helisy α – wymiary helisy oraz budowa prawoskrętna helisy. (b) Struktura fałdowa.
Struktura trzeciorzędowa określa ogólny kształt, jaki przyjmuje pojedynczy łańcuch polipeptydowy i zależy on od oddziaływań między łańcuchami bocznymi aminokwasów wchodzących w jego skład.
Rys. 4. Struktura trzeciorzędowa łańcucha polipeptydowego.
Wiele aktywnych biologicznie białek składa się z dwóch lub większej liczby łańcuchów polipeptydowych, połączonych specyficznym wzajemnym oddziaływaniem. Struktura czwartorzędowa jest wynikiem nałożenia się przestrzennych struktur współdziałających łańcuchów polipeptydowych, każdego o własnej strukturze pierwszo-, drugo- i trzeciorzędowej.
Rys. 5.Struktura czwartorzędowa białka.
Masa cząsteczkowa białek waha się w granicach od 10 000 Da do wielokrotności miliona i ze względu na swoją wielkość nie tworzą one roztworów rzeczywistych tylko koloidowe. Ponieważ aminokwasy wchodzące w skład cząsteczki białka nadają jej określony ładunek, rozproszone cząsteczki mają charakter hydrofilowy i otaczają się podobnie jak jony nieorganiczne „płaszczem wodnym”. Otoczka wodna chroni te cząsteczki przed łączeniem się w większe zespoły, a tym samym przed wytrąceniem z roztworu.
Obecność w białkach aminokwasów o charakterze jonowym nadaje cząsteczkom białkowym ładunek elektryczny, który jest wypadkową wszystkich dysocjujących grup. Jego wartość i znak zależą od pH środowiska, co jest związane z zależnymi również od pH stopniami dysocjacji wszystkich tych grup. Dla każdego białka istnieje określona wartość pH, przy której wszystkie ładunki równoważą się i jego ładunek sumaryczny równa się zeru. Ta wartość pH, podobnie jak dla aminokwasów, nazywa się punktem izoelektrycznym białka (pI). Znajomość pI ma duże znaczenie przy charakteryzowaniu białek oraz ich rozdzielaniu. W punkcie izoelektrycznym rozpuszczalność białek jest najmniejsza i najłatwiej można je wtedy wytrącić z roztworu oraz wykrystalizować. Poza tym białka w pI wykazują najmniejsze ciśnienie osmotyczne, najsłabiej pęcznieją, mają najmniejszą lepkość i nie reagują z anionami ani kationami.
Białka są związkami bardzo wrażliwymi na wpływ wielu różnych czynników, które mogą spowodować nieodwracalne zmiany w ich strukturze i utratę ich właściwości biologicznych, co określa się jako denaturację. W wyniku denaturacji zniszczona zostaje wtórna struktura białka, natomiast struktura pierwotna (pierwszorzędowa) nie ulega zmianie. Zachowane pozostają więc w procesie denaturacji mocne wiązania peptydowe, a zniszczeniu mogą ulegać tylko słabe wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe.
Denaturacja białka może nastąpić pod wpływem podwyższonej temperatury, zbyt niskiego lub zbyt wysokiego stężenia jonów wodorowych (a więc kwasów i zasad), wysokich stężeń jonów metali ciężkich, rozpuszczalników organicznych (alkohol lub aceton) i wielu innych czynników. W wyniku denaturacji obniża się najczęściej rozpuszczalność białka i wypada ono z roztworu w postaci osadu.
Aktywność biologiczna białka zależy od jego ukształtowania w przestrzeni – konformacji, dlatego też metody wyodrębniania i frakcjonowania muszą być na tyle łagodne, aby nie zniszczyć słabych wiązań utrzymujących tę strukturę i nie spowodować denaturacji białka.
Częstym sposobem frakcjonowania białek jest ich wysalanie za pomocą siarczanu amonowego. Przy mniejszych stężeniach wytrącane są np. z roztworu białka kurzego globuliny, a przy całkowitym nasyceniu roztworu białka siarczanem amonowym wytrącane są albuminy. Zjawisko wysalania ma charakter odwracalny i wiąże się ze zmniejszeniem stopnia uwodnienia zdysocjowanych grup aminokwasowych R występujących na powierzchni białka. Cząsteczki białka wskutek utracenia cząsteczek wody przez silnie zdysocjowane jony soli asocjują wówczas i ulegają wytrąceniu w formie osadu. Najłatwiej jest wysolić białko z roztworu, gdy znajduje się ono w punkcie izoelektrycznym.
Część doświadczalna.
Odczynniki:
1. Roztwór białka kurzego.
2. Roztwór kazeiny.
3. 1 M roztwór CH3COOH
4. 10% roztwór kwasu trichlorooctowego
5. Krystaliczny siarczan amonowy
6. 1% roztwór FeCl3.
7. 1% roztwór CuSO4.
Wykonanie ćwiczenia:
1. Zmiana rozpuszczalności białka jaja kurzego w obecności soli (wysalanie).
Tylko te białka są rozpuszczalne w wodzie, w których składzie przeważają aminokwasy o charakterze hydrofilnym nad hydrofobowymi. Hydrofilność reszt aminokwasowych w łańcuchu białkowym można osłabić przez zmianę pH lub w obecności stężonych roztworów soli.
Następstwem działania tych czynników będzie wytrącania się białka z roztworu. Zmianę rozpuszczalności białek w wodzie można prześledzić na przykładzie roztworu białka jaja kurzego.
Wykonanie:
Wlej do małej zlewki 20ml 2- krotnie rozcieńczonego w 0,1 M NaCl, roztworu jaja kurzego. Dodawaj małymi porcjami około l2g (NH4)2SO4. Obserwuj zmętnienie roztworu. Przenieś mętny roztwór do woreczka dializacyjnego i zanurz woreczek w zlewce z wodą. Zlewkę postaw na mieszadle magnetycznym. Obserwuj jak w miarę ubywania soli z woreczka następuje stopniowe, postępujące od ścianek woreczka, klarowanie się roztworu. Wytłumacz mechanizm wytrącania się białka. Zastanów się, czy to zjawisko można by wykorzystać do rozdzielenia od siebie (frakcjonowania) białek? Zastanów się również na czym polega proces dializy czyli dyfuzji przez błony półprzepuszczalne.
2. Oznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny.
W ćwiczeniu tym wykorzystuje się najmniejszą rozpuszczalność kazeiny w punkcie izoelektrycznym. Odpowiednio dobierając stężenia CH3COOH i CH3COONa przygotowuje się szereg probówek z roztworami o różnych wartościach pH. Dodaje się do nich jednakową ilość kazeiny. Wartość pH w probówce, w której wystąpi najobfitszy osad odpowiada pI kazeiny.
Przygotowanie roztworu kazeiny: Do kolbki miarowej (50 ml) odważyć 0,25 g kazeiny i dodać 25 ml wody (ogrzanej do 400C) oraz 5 ml roztworu NaOH. Mieszać aż do rozpuszczenia się kazeiny, po czym wprowadzić 5 ml 1 M roztworu CH3COOH i uzupełnić do kreski wodą. Otrzymuje się w ten sposób lekko opalizujący roztwór kazeiny w 0.1 M roztworze CH3COONa.
Przygotować 9 probówek stożkowych z nakrętką. Do pierwszej odmierzyć 3,2 ml 1 M roztworu CH3COOH i 6,8 ml wody, a do następnych ośmiu – po 5 ml H2O. Po dokładnym wymieszaniu zawartości w probówce pierwszej, przenieść z niej 5 ml do drugiej, a z tej po wymieszaniu, 5 ml do trzeciej itd. Do każdej probówki dodać po 1 ml roztworu kazeiny i wymieszać. Obserwować roztwory natychmiast po zmieszaniu i po 30 min. Wynik wpisać do tabelki:
Numer probówki 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH roztworu 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 5,0 5,3 5,6 5,9
Zmętnienie
Osad
3. Wytrącanie białka kwasem.
Cząsteczki białka o ładunku dodatnim wykazują zdolność nieodwracalnego łączenia się z anionami niektórych kwasów, dając nierozpuszczalne sole.
Do 2 ml białka jaja kurzego wprowadzić 2 ml 10% roztworu kwasu trichlorooctowego.
4. Strącanie białka za pomocą soli metali ciężkich.
a) Do 1 ml roztworu białka dodać parę kropli 1% roztworu FeCl3. Wytrąca się brunatny osad białczanu żelazowego, rozpuszczający się w nadmiarze odczynnika.
b) Do 1 ml roztworu białka dodać parę kropli 1% roztworu CuSO4. Powstaje jasnobłękitny osad białczanu miedziowego, który rozpuszcza się w nadmiarze NaOH, dając kolor fioletowy (reakcja biuretowa).
5. Denaturacja cieplna białka.
Wysoka temperatura powoduje rozerwanie wiązań wodorowych i oddziaływań hydrofobowych w białku.
Do probówki odmierzyć 2 ml roztworu białka kurzego i zawartość ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej.
Wyniki i wnioski wynikające z wykonanych ćwiczeń zapisać w zeszycie.
4
kolo205