AiN_1-1997-04.pdf

(392 KB) Pobierz
Alkoholizm
i
Narkomania 1126/97
Bogdan SzukaIski, Ewa Mirkiewicz, Ewa Taracha
Biochemii
Instytut Psychiatrii i Neurologii w Warszawie
Zakład
BADANIA AMFETAMINY
,
I JEJ PSYCHOAKTYWNYCH ANALOGOW
,
W MOCZU NARKOMANOW
METODĄ
FPIA I HPTLC
WSTĘP
Produkcja amfetaminy w nielegalnych laboratoriach
działających
w wielu regio-
nach kraju
zwiększa dostępność
tego narkotyku
wśród
polskich narkomanów i spra-
wia,
że
coraz
częściej
na
oddziały
detoksykacyjne - obok pacjentów
stosujących
przetwory ze
słomy
makowej -
trafiają
narkomani
uzależnieni
od amfetaminy. W
USA i krajach zachodniej Europy
poważny
problem
stanowią również
analogi struk-
turalne amfetaminy i metamfetaminy - tzw. "narkotyki zmodyfikowane" (designer
drugs).
Są
to produkty strukturalnej modyfikacji
środków
psychoaktywnych
obję­
tych
kontrolą międzynarodową
(tj.
występujących
na listach I i II
amerykańskiej
Drug
Enforcement Agency - DEA), które
zachowując wysoką psychoaktywność mogły
być
legalnie syntetyzowane,
choć
okresy tej
legalności
(czyli braku na listach I i II
DEA)
były
bardzo krótkie [5]. Do
określenia
tego typu
związków używany
jest rów-
nież
termin "analogi substancji
pozostających
pod
kontrolą"
(controlled substances
analogues) [14].
Do najbardziej znanych narkotyków zmodyfikowanych
należą:
tenamfetami-
na (MDA), 3,4--metylenodioksymetamfetamina (MDMA), 2,5-dimetoksy-4- me-
tyloamfetamina (DOM) i inne. (Ryc. l i 2).
Według
klasyfikacji Drug Enforce-
ment Administration
znajdują się
one
na
liście
I (Schedule I),
grupującej związ­
ki o wysokim potencjale
uzależniającym,
bez
wyraźnego
zastosowania lekar-
skiego [3]. Rozpowszechnienie tych narkotyków w Stanach Zjednoczonych wzro-
sło
ostatnio znacznie i ich identyfikacja w materiale biologicznym
pochodzącym
33
Bogdan Szuka Iski, Ewa Mirkiewicz, Ewa Taracha
od narkomanów
należy
tam do podstawowych
kologicznych [2, 4, 11].
RYCINA l
Budowa chemiczna amfetaminy
i
metamfetaminy
Amfetamina
obowiązków
laboratoriów toksy-
Metamfetamina
Ol""' Ol""'
NH,
NH CH,
(2-amino-l-fenylopropan)
Wśród
(2-(metyloamino)-1-fcnylopropan)
narkotyków zmodyfikowanych na
szczególną
uwagc<
zasługują
tzw. entak-
togeny (entactogens) stosowane czc<sto jako
środki odurzające
w dyskotekach oraz
na tzw. "raving parties" - imprezach
mających
na celu wspólne
przeżywanie oszoło­
mienia narkotycznego.
Należą
do nich
związki posiadające
ugrupowanie 3,4-diok-
symetylenowe:
3,4 - metylenodioksyamfetamina (MOA)
3,4 - metylenodioksymetamfetamina (MDMA, Ecstasy)
N-etylo-3,4-metylenodioksyamfetamina (MDE, MOEA, "Eve")
Benzodioksalo-5-butylo-2-amina (BOB) - homolog MOA o
łańcuchu dłuższym
o grupc<
metylenową,
N-Metylobenzodioksalo-5-butylo-2-amina (MBOB) - homolog MOMA o
łań­
cuchu bocznym
dłuższym
o grupc<
metylenową,
Analogiem strukturalnym amfetaminy jest
również różniąca
sic< od niej tylko obec-
nością
grupy hydroksylowej w
łańcuchu
bocznym - katyna (cathine), narkotyk po-
chodzenia
roślinnego
otrzymywany z
liści
drzewa Catha edulis Forks (Ryc. 2).
W Polsce,
cieszącej się
w Europie
niedobrą sławą czołowego
producenta i ekspor-
tera nielegalnie otrzymywanej amfetaminy,
prawdopodobieństwo
pojawienia
się
na
rynku produktów chemicznej modyfikacji tego narkotyku jest
dość
wysokie. Musi-
my
więc mieć świadomość, że
w moczu narkomanów, badanym na
obecność
amfeta-
miny,
mogą znajdować się również
jej analogi strukturalne.
Amfetaminę można wykrywać
w moczu za
pomocą różnych
testów immuno-
logicznych - testu
płytkowego
Ontrak (Hoffmann-La Roche), testu paskowego
Frontline (Boehringer Mannheim), zestawu wielozadaniowego Triage (Merck) a
także
metody immunofluorescencji w
świetle
spolaryzowanym - FPIA (Abbott).
Najbardziej rozpowszechniona jest ta ostatnia metoda,
gdyż
pozwala nie tylko
wykrywać obecność
amfetaminy, ale
również określać
jej
przybliżone stężenie
w badanej próhce.
34
Badania amfetaminy
i
jej psychoaktywnych analogów w moczu narkomanów
metodą
FPlA
i
HPTLC
RYCINA 2
Budowa chemiczna niektórych analogów strukturalnych amfetaminy
i
metamfetaminy
NH,
CH,
CH,
MDA
MDMA
(3, 4-metylenodioksyamfetamina)
NH,
(3, 4-metylenodioksymetamfetamina)
HO
HcJO
CH,
CH,
NH CH 3
DOM
(2,5-dimetoksy-4-metyloamfetamina)
H
4-0H-MA
(4-hydroksymetamfetamina)
Ij
KATYNA
(2-amino-fenylopropanol-l)
tej metody, która opiera si« na reakcji antygen -
przeciwciało,
jest
jednak niezbyt wysoka
specyficzność, gdyż
z
przeciwciałami
skierowanymi przeciw
amfetaminie
reagują również związki
o
zbliżonej
do amfetaminy budowie chemicz-
nej (tzw.
reaktywność krzyżowa). Może
to
prowadzić
do
bł«dnych
wyników zarów-
no
jakościowych
jak i
ilościowych.
Wyniki badania amfetaminy i metamfetaminy
metodą
immunofluorescencji w
świetle
spolaryzowanym
zależą również
od metabolizmu tych narkotyków i obecno-
ści
w moczu ich metabolitów. Np.
aż
15% przyj«tej dawki metamfetaminy przekszta-
łca się
w jej metabolit 4-hydroksymetamfetamin« [13] (Ryc. 2).
Dlatego wydaje si« uzasadnione zbadanie zachowania
ważniejszych
psycho-
aktywnych analogów amfetaminy wobec
przeciwciał
testu amfetaminowego FPIA
oraz opracowanie prostego post«powania analitycznego do ich wykrywania i iden-
tyfikacji. Dodatni wynik badania moczu
metodą
FPIA oznacza bowiem jedynie
35
Słabą stroną
Bogdan Szukajski, Ewa Mirkiewicz, Ewa Taracha
w nim amfetaminy w
stężeniu przekraczającym
tzw. próg
czułości
(cut
off level), nie wskazuje natomiast jakie
związki składają się
na ten wynik. Ich
identyfikacja musi
się więc odbywać inną metodą,
np.
metodą
chromatografii
gazowej (GC), chromatografii gazowej
sprzężonej
ze
spektrometrią masową
(GC!
MS) lub wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC).
Wśród
nich HPTLC
wyróżnia się względną prostotą
wykonania, a ponadto nie wymaga
kosztownej aparatury i
może więc być
stosowana w
większości
naszych labora-
toriów toksykologicznych.
MATERIAŁ
obecność
I METODY
Amfetaminę
(siarczan d-amfetaminy),
metamfetaminę
(chlorowodorek d-metam-
fetaminy), MOA (chlorowodorek dl-3,4 - metylenodioksyamfetaminy), MDMA
(chlorowodorek dl-3,4-metylenodioksymetamfetaminy), DOM (chlorowodorek dl-
2,5-dimetoksy- 4 -metyloamfetaminy),
4-hydroksymetamfetaminę
(Pholderin)
i
katynę
(chlorowodorek norpseudoefedryny) przygotowywano w postaci meta-
nolowych roztworów podstawowych o
stężeniu
l mg/mI, które
następnie
doda-
wano do czystego moczu (pH 5-8), aby
stężenia
poszczególnych
związków
wy-
nosiły
w nim 300, 500, 1000, 1500,2000,3000,5000 i 6000 ng/ml. Amfetamina,
met amfetamina, MOA, MDMA, 4-hydroksymetamfetamina i DOM
pochodziły
z
finny Sigma, natomiast katyna jest darem Division ofNarcotic Drugs, Vienna Internatio-
nal Centre, ONZ.
Oznaczenia wykonywano
metodą
immunofluorescencji w
świetle
spolaryzowa-
nym (FPIA) [8,15] przy
użyciu
zestawu TDx Amphetamine lMetamphetamine As-
say System (IDO-test Kit Nr 12610QIOI).
Materiałem użytym
do identyfikacji amfetaminy i jej strukturalnych analogów
był
mocz 10 pacjentów
Oddziału
Detoksykacyjnego Instytutu Psychiatrii i Neurologii,
wybranych
spośród
106 uczestników programu metadonowego. W moczu tych pa-
cjentów badanie skriningowe
wykazało obecność związków
z grupy amfetamin, co
stanowi dowód nieprzestrzegania przez nich abstynencji,
będącej
warunkiem udzia-
łu
w programie metadonowym.
Do
rozdziału
i identyfikacji poszczególnych
związków składających się
na
"pulę
amfetamin" zastosowano
metodę
wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwo-
wej [6,7].
Izolację
amfetamin z moczu przed
analizą chromatograficzną
prowadzono
metodą
ekstrakcji
ciecz-ciało stałe
(Solid Phase Extraction - SPE) [1,7,12]
stosując
kolum-
ny (Bond Elut Certify Extraction Columns - Varian) z sorbentem krzemionkowym,
umieszczone w specjalnym
urządzeniu
do prowadzenia ekstrakcji pod
regulowaną
próżnią
(Analytichem Vac Elut SPS 24™_Varian).
Kolumnę
przygotowywano
do analizy
przepuszczając
kolejno 2 mI metanolu i 2 mI 0,1 mI buforu fosforano-
wego o pH 6, a
następnie
podawano na
nią próbkę
badanego moczu
(najczęściej
10 mI),
płukano kolumnę
2 mI l M kwasu octowego i suszono pod
próżnią
w
ciągu
5 minut.
Wysuszoną kolumnę płukano
10 mI metanolu i powtórnie suszo-
36
Badania amfetaminy i jej psychoaktywnych analogów w moczu narkomanów
metodą
FPlA i
HPTLe
no przez 2 minuty. Zaadsorbowane amfetaminy eluowano 2 m12% roztworu amo-
niaku w octanie etylowym. Eluat odparowywano do sucha i rozpuszczano w 50 )lI
metanolu. Na
płytki
chromatograficzne nanoszono 1-1O)l1 ekstraktu, co odpowiada
0,2-2 mi moczu.
Zastosowana w pracy metoda ekstrakcji ciecz-cialo stale izoluje z moczu, poza
amfetaminą
i jej psychoaktywnymi analogami,
również
metadon i jego metabolit 2-
etylideno-l,5-dimetylo -
3,3-difenylopirolidynę
(EDDP), które po wywolaniu chro-
matogramów
ninhydryną pojawiają się
na nich w postaci fioletowych plam.
Do
rozdziału
amfetamin zastosowano dwa warianty chromatografii: wariant kla-
syczny i tzw.
chromatografię
z odwróconymi fazami (Reversed Phase Chromatogra-
phy), w której faza ruchoma jest bardziej polarna
niż
nieruchoma [lO].
W wariancie klasycznym
używano płytki
10 x 10 cm pokryte
żelem
krzemionko-
wym (Silica - gel G 60 F"4- Merck), a w wariancie z odwróconymi fazami -
płytki
takiej samej
wielkości
pokryte adsorbentem RP-18
2545-
(Merek). Chromatogramy
rozwijano w komorach szklanych (Camag, Muttenz) na drodze o
długości
7 cm, sto-
sując następujące układy rozwijające:
l.
Metanol:
stężony
roztwórNH,
=
100: 1,5
Układ
2. Toluen: aceton: etanol- 25% roztwór NH,
=
45:45:7:3
Układ
3. Chloroform: metanol
=
90:10
Układ
4. Octan etylu: metanol: woda
=
95: 3,5: -1,5 z dodatkiem 7 )lI
stężonego
roztworu amoniaku na 1 mi mieszaniny
Układ
5. Aceton z dodatkiem 5 )lI
st<{żonego
roztworu amoniaku na lml acetonu.
Układ
6. (do chromatografii z odwróconymi fazami). Metanol: woda: 37% roz-
twór kwasu solnego
=
50: 50: l.
Czas rozwijania chromatogramów
wynosił
8-10 minul.
Rozdzielone
związki
lokalizowano na chromatogramach za
pomocą
lampy UV
(254 nm) oraz odczynników: ninhydrynowego i Fast Black K (FBK)
Odczynnik ninhydrynowy. 10% roztwór ninhydryny w etanolu.
Płytki
spryskane odczynnikiem ninhydrynowym ogrzewano w piecu o temperatu-
rze 120"C przez 15 minul.
Odczynnik Fast Black K [9]
Roztwór A: l % wodny roztwór Fast Black K
Roztwór B: l M roztwór wodorotlenku sodowego
Płytki
spryskiwano roztworem A,
następnie
- roztworem B. Bardziej inten-
sywne zabarwienie uzyskiwano
spryskując
wysuszony chromatogram powtórnie
roztworem A.
Wartości
hR"
charakteryzujące szybkość
migracji badanych substancji na chroma-
togramach, obliczono wg wzoru:
Układ
gdzie
droga przebyta przez
cząsteczkę
narkotyku
IR -
droga przebyta przez
czoło
fazy ruchomej,
37
~
-

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin