RATOWNICTWO MEDYCZNE - 2010
ĆWICZENIA 1
WYKONANIE PREPARATU MIKROSKOPOWEGO:
1. Rozmaz:
Prosty preparat mikroskopowy sporządzamy na szkiełku podstawowym w postaci tzw. rozmazu. Na czyste, odtłuszczone i opalone w płomieniu palnika szkiełko nanosimy kroplę soli fizjologicznej 0,85% i ezą nanosimy jedną lub kilka kolonii bakterii. Ezą łączymy bakterie i kroplę soli fizjologicznej, rozprowadzając płyn z bakteriami po powierzchni, tworząc rozmaz. Preparat mona też przygotować z zawiesiny bakteryjnej w soli fizjologicznej - nakropić kropelkę zawiesiny pipetą na szkiełko podstawowe i zrobić rozmaz.
2. Suszenie:
Preparat musi wyschnąć na powietrzu. Nie suszymy preparatu w płomieniu palnika chcąc przyspieszyć wysychanie, ponieważ obecne w płynie bakterie zostaną „ugotowane”, co może spowodować pęknięcie/zniszczenie ściany komórkowej podczas gotowania, a wówczas bakterie nie będą prawidłowo się wybarwiać, co może spowodować błędną ocenę morfologiczną.(Ponieważ barwienie metodą Grama wykorzystuje różnice w budowie ściany komórkowej pomiędzy bakteriami, prawidłowa struktura ściany ma wpływ na prawidłowe zabarwienie się bakterii.)
3. Utrwalanie:
Dopiero suchy preparat utrwala się w płomieniu palnika. Ogrzanie w płomieniu palnika jest najpowszechniej stosowaną metodą utrwalania preparatów. Utrwalenie bakterii ma na celu zabicie bakterii, bo żywe bakterie nie przyjmują barwnika, a ponadto dzięki utrwaleniu bakterie są mocno przyczepione do szkiełka i nie zostaną spłukane z jego powierzchni podczas barwienia.
Barwienie złożone:
W mikrobiologii najczęściej stosuje się barwienie złożone, w którym wykorzystuje się oprócz barwnika lub dwóch, również zaprawy (bejce) i odbarwiacze.
1. Barwniki:
§ fiolet krystaliczny
§ fuksyna zasadowa lub safranina
2. Zaprawy (bejce): substancje ułatwiające barwienie przez wzmocnienie działania barwnika. Zaprawą jest
§ płyn Lugola
3. Odbarwiacze: substancje pozwalające na uwidocznienie pewnych bakterii lub pewnych szczegółów ich budowy, dzięki odbarwieniu innych bakterii lub ich części.
§ alkohol etylowy (najlepiej z dodatkiem acetonu)
Barwienie bakterii metodą Grama:
Barwienie preparatów tą metodą jest barwieniem złożonym. Metoda ta została zaproponowana po raz pierwszy pod koniec XIX wieku przez duńskiego bakteriologia Hansa Christiana Grama do barwienia bakterii w histologicznych preparatach tkanek zwierzęcych.
Barwienie metodą Grama jest złożoną metodą barwienia – wykorzystuje 2 barwniki, zaprawę i odbarwiacz. Preparat utrwala się w płomieniu palnika. Utrwalony i wystudzony preparat barwi się fioletem krystalicznym lub fioletem goryczkowym (1 – 2 minuty). Następnie spłukuje się fiolet wodą i barwi się preparat płynem Lugola (wodny roztwór J w KJ, jodyna). Po wniknięciu do wnętrza komórek bakteryjnych jod tworzy wewnątrz komórki bakteryjnej kompleks z barwnikiem, czyli z fioletem. Przez tworzenie kompleksów płyn Lugola wzmacnia działanie barwnika. Płynem Lugola zabarwia się preparat ok.1- 2 minut, po czym spłukuje wodą. Następnie preparat odbarwia się alkoholem - etanolem (z acetonem), około 20 - 30 sekund. Odbarwianie prowadzi się aż do momentu, kiedy spłukiwany alkohol jest bezbarwny. Barwny, fioletowy kompleks wymywa się z komórek o cieńszych ścianach komórkowych (gramujemneych) i te komórki odbarwiają się alkoholem, natomiast nie wymywa się z komórek o grubych ścianach komórkowych (gramdodatnich) i te komórki pozostają fioletowe.
Ostatnim barwnikiem jest safranina lub fuksyna. Jest to drugi barwnik. Safranina jest ciemno różowa i wybarwia bakteria na różowo. Jest to barwienie kontrastowe. Safranina wybarwia na różowo zarówno komórki gramdodatnie jak i gram ujemne, jednak na ciemno fioletowych komórkach gram dodatnich jasnego, różowego barwnika nie widać. Gramujemne komórki odbarwione na bezbarwny kolor przez alkohol zabarwią się na różowo, natomiast w przypadku komórek gramdodatnich, z grubymi ścianami komórkowymi, które zatrzymały fioletowy kompleks, różowy kolor będzie niewidoczny.
Barwienie jako metoda diagnostyczna:
Klasyczna, szybka metoda diagnostyczna. Precyzyjna identyfikacja bakterii nie jest możliwa (nie przydzielimy bakterii go gatunku, ani nawet rodzaju czy rodziny na podstawi preparatu mikroskopowego), ale morfologia i sposób barwienia oglądanego mikroorganizmu ogranicza liczbę prawdopodobnych czynników etiologicznych, dostarcza podstaw do ustalenia empirycznej terapii przeciwbakteryjne
Cechy różnych kolonii różnych bakteryjnych:
§ Wielkość – średnica w mm
§ Kształt – okrągły, nieregularny, rozgałęziony, nitkowaty, mogą nie tworzyć pojedynczych kolonii tylko zarastać całe podłoże lub kolonie rozpełzające się po podłożu
§ Brzeg kolonii – gładki, falisty, regularny, nieregularny, płatowaty regularny lub nieregularny, ząbkowany regularny lub nieregularny, nitkowaty
§ Powierzchnia kolonii – gładka, pomarszczona, lśniąca, matowa
§ Barwa i przejrzystość – przezroczysta, mętna, opalizująca, nieprzejrzysta, barwna (zdolność do wytwarzania pigmentu: S. aureus – kremowe lub żółtawe, Micrococcus – żółte, Pseudomonas na MH – zielony, żółty, niebieski, czerwony)
§ Konsystencja (struktura) – zwarta, drobnoziarnista, gruboziarnista, luźna
§ Profil kolonii – płaski, wzniosły, soczewkowaty niski/wysoki, pępkowaty, kraterowy
TYPY PODŁÓŻ:
Agar krwawy – podłoża diagnostyczne z dodatkiem krwi należą do podłóż wzbogaconych, a więc umożliwiają wzrost bakterii o dużych wymaganiach pokarmowych. Podłoże krwawe zawiera dodatek krwi, 5-10% odwłóknionej krwi baraniej.
Podłoże MacConkeya – podłoże diagnostyczno wybiórcz, służy do izolacji PG- z materiałów klinicznych. Zawartość soli żółciowych i fioletu krystalicznego hamuje wzrost bakterii gramdodatnich i tych gramujemnych, które mają duże wymagania wzrostowe. Zawartość laktozy jako jedynego cukru w tym podłożu umożliwia różnicowanie pałeczek na laktozododatnie, czyli takie, które mają zdolność do rozkładu laktozy i laktozoujemne, czyli takie, które nie mają zdolności do rozkładu laktozy. W obecności barwnika wskaźnikowego – czerwieni obojętnej – wskutek zależnego od rozkładu laktozy zakwaszenia środowiska, kolonie rozkładające laktozę zabarwiają się na kolor różowy, a laktozoujemne pozostają bezbarwne lub przyjmują kolor podłoża.
· Bakterie laktozododatnie – E. coli są otoczone różową strefą wytrąconych kwasów żółciowych
· Pałeczki laktozoujemne – Shigella, Salmonella, Pseudomonas, Serratia - mają bezbarwne kolonie.
Podłoże z żółcią i eskuliną BE (bile-eskuline agar) (tzw. coco-gel) – podłoże przeznaczone do izolacji i identyfikacji paciorkowców, enerokoków. Bakterie z rodzaju Enterococcus mogą rosnąć w obecności żółci i mają zdolność do hydrolizy eskuliny, jednego ze składników podłoża. W skład podłoża wchodzi również cytrynian amonowo-żelazowy. Podczas wzrostu eskulina jest rozkładana do eskuletyny i glukozy. Zaczernienie pożywki powoduje właśnie eskuletyna, która wiąże się z cytrynianem amonowoelazowym w kompleksy.
· Zaczernienie pożywki powodują wszystkie enterokoki i paciorkowce z grupy D (Streptococcus bovis)
· Niektóre paciorkowce jamy ustnej (S. salivarius, S. mutans, S. mitis, S. constellatus,) – mogą powodować jasnoszare zabarwienie.
Podłoże Chapmana – jest to podłoże diagnostyczno-wybiórcze przeznaczone do izolacji gronkowców z materiałów klinicznych. Duże stężenie NaCl (7,5%) hamuje wzrost flory towarzyszącej, a szczególności bakterii gramujemnych. Podłoże zawiera mannitol. Rozkład mannitolu przez S. aureus powoduje zabarwienie się kolonii i podłoża na żółto, inne gronkowce (gronkowce koagulazoujemne) nie rozkładające mannitolu mają różowe kolonie różowe.
Podłoże Muellera-Hinton – podłoże rutynowo stosowane do oznaczania lekowrażliwości metodą krążkowo-dyfuzyjną. Nie zawiera składników, które utrudniałyby dyfuzję lub wchodziły w interakcje ze związkiem zawartym w krążku. Dodatek do podłoża krwi baraniej umożliwia wykonanie antybiogramu metodą krążkową bakterii o dużych wymaganiach odżywczych (Mueller-Hinton z krwią) np. paciorkowców z rodzaju Streptococcus.
TYPY HEMOLIZY:
Hemoliza α – polega na wystąpieniu dookoła zielonkawej, matowej strefy na skutek przekształcania hemoglobiny w methemoglobinę.
Przykłady: paciorkowce zieleniące (paciorkowce z rodziny viridans – odpowiedzialne za zapalenia wsierdzia, próchnicę zębów, S. mitis, S. mutans, S. oralis), S. pneumoniae,
Hemoliza β – polega na przejaśnieniu podłoża wokół kolonii na skutek całkowitego rozpuszczenia erytrocytów i wyługowaniu barwinka.
Przykłady: S. agalactiae, S.pyogenes
Hemoliza γ – to brak hemolizy, otoczenie kolonii nie zmienia się, a bakterie powodujące ten typ hemolizy określa się mianem niehemolizujących.
Przykłady: E. faecalis E. faecium
Literatura:
Życie bakterii – Władysław J. H. Kunicki-Goldfinger,
Mikrobiologia – różnorodność, chorobotwórczość i środowisko – Abigail A. Salyers, Dixie D.Whitt, s
Diagnostyka bakteriologiczna – red. naukowy Eligia M. Szewczyk
3
Lauviah666