RT-PCR kompetycyjny Zmodyf. standardy zewnę.: przygotowanie stand. podobnych do bad. sekwencji (insercja, delecja w badanym genie, + lub – m-ca restryk.; dodanie określonej ilości standard. RNA do badanego RNA; mRNA przekształcany w cDNA przez RT, następnie amplifikowany PCR; składniki reakcji w nadmiarze; czynn. limit-owanym jest liczba kopii cDNA; amplifik. stand. wewnętrznego (kompetytora) i sekw. docelowej powinna być podobna, jeśli mają podobną dł.; Synteza kompetytora– trans-krypcja in vitro na matrycy DNA, T7 polimeraza RNA w obecności znakowanego nt [a-32P]GTP lub [a-32P]ATP; Sekw. kompetycyjnego RNA różni się od docelowego RNA (delecja, insercja, inne mutacje łatwe do detekcji). Elektroforeza w denaturując-ym żelu poliakryloamidowym, oczyszczanie kompetytora z żelu (elucja), Oznaczenie ilości kompetytora w liczniku scyntylacyjnym: mM komp. RNA= (cpm/ml oczyszcz. RNA / cpm/ml miesz. transkr.)*(500 mM GTP/ATP / #G lub A w komp. RNA); kopie komp. RNA/ml=(cpm/ml oczyszcz. RNA / cpm/ml miesz. transkr)*(3x1014 cząst. GTP/ATP/ml / #G lub A w komp. RNA). Wzrastające stężenia kompetytora są dod-awane do badanej próbki RNA; jeśli takie same ilości produktu PCR powstają z komp-etycyjnego i endogennego RNA po RT-PCR, wyjściowa ilość kopii docelowego RNA równa dodanemu kompetytorowi (analiza w żelu agarozowym). 5’RACE Synt. pierw-szej nici DNA na całkowitym RNA/mRNA i specyficznym starterze (GSP1) podczas reakcji RT; Dodanie poliA do 3’ końca pierwszej nici cDNA: terminalna transferazy + dATP, reakcja TdT; Amplifikacja cDNA przy użyciu drugiego startera specyficznego (GSP2) oraz startera oligo(dT); Amplifikacja cDNA przez PCR zlokaliz. z użyciem trzeciego startera specyficznego (SP3) i startera oligo(dT) komplementar. do fragmen-tu poliA 3’ RACE Synt. pierwszej nici cDNA z wykorzyst. całkowitego RNA/mRNA przy użyciu startera oligo(dT); Synteza podwójnej nici DNA przy użyciu startera spec-yficznego (GSP1) oraz startera oligo(dT); RACE Invitrogen Startery 50-70% G/C (temp. przyłączania wysoka 72C); Dł. 23-28 nt (zwięk. specyficzność); Mało G/C na 3’ końcu (eliminować wydłuż. w innych m-ach niż żądane), nie więcej niż 2 G/C w ostatnich 5 nt startera; Sekw. starterów nie komplementarne między sobą; Temp. przy-łączania powyżej 72C (zwiększa specyf. można „touch down”); Zast. starterów do „ne-sted”; Defosforylacja RNA fosfataza alkaliczna, CIP; Usunięcie czapeczki z 5’ końca pełnego mRNA (pirofosfatazy, TAP); Ligacja GeneRacer RNA Oligo do 5’ końca mRNA pozabawionego czapeczki (sekw. dla starterów); Reakcja RT (AMV RT lub Superscript II RT) starter specyficzny do sekwencji genu; Amplifikacja końców cDNA PCR z zastosowaniem wybranych starterów Odwrócony PCR Określanie pełnej sekw. genu lub sekw. sąsiadujących (kodujących/regulatorowych); Odpowiednik RACE dla genomowych lub niegenomowych sekw. prokar. lub niższych Eukaryota o nieskomplikowanym genomie; Do iPCR trzeba znać krótką sekw. genu lub elementu regulatorowego; W odróżnieniu od RACE matrycą jest DNA
Taq 5’-3’ egzonukleaza; 1.3x10-5 - 8x10-6; dodawanie A na końcach 3’; 2000 nt/min Pfu 3’-5’ egzonukleaza; 1.3x10-6; 1000/min CYKLE Den. wstępna 92-98°C 30 sek. - 8 min. Den. 92-98°C 15 sek. – 1 min. Przyłączanie ok. 45°-70°C 15 sek. – 1 min. Poli-meryzacja 65-78°C 30s – 10 min (0,5-2 kpz/min.) Końcowe wydłużanie 72°C 2 min.- 30 min. Produkty reakcji w głównej fazie PCR powstają geometrycznie; później rea-kcja osiąga plateau Siła jonowa buforu (gł. st. K+) i st. Mg2+ (0,5-5 mM) kontrolują specyficzność przyłączania starterów pH 8,3-8,8 DODATKI Związki zmniejszające wewnętrzne oddziaływania drugorzędowe matryc. DNA (GC rich): DMSO, detergenty niejonowe (np.: Tween20, 0,1-2,5%), glikol polietylenowy. Stand. st. Mg2+ (MgCl2) dla Taq - 1,5 mM; dNTP zmniejszają ilość wolnego Mg2+; Pwo woli MgSO4; Poli. „proofreading” większego st. Mg2+; B. duże st. Mg2+ (powyżej 3,0 mM) zwiększają szanse na otrzymanie produktu, ale liczba błędów wzrasta. Inhibitory i zanieczyszcze-nia: chelatory (EDTA); nukleazy (degradacja matrycy); proteazy; RNA, heparyna; por-firyny; niektóre detergenty (SDS powyżej 0,01%); Zmiana parametrów reakcji zm. temp. i time przyłączania – PCR gradientowy dla kilku reakcji testowych; zm. parame-trów denaturacji – zwiększenie temp. i time; zwięk. speed zmian temp. (ramping rate); zwiększ. liczby cykli – większa wydajność; Do czego sekwencje prod. PCR ze zdeg-enerowanych starterów: Identyfikacja i izolacja nieznanych genów; sonda do biblio-teki genomowej lub cDNA; Izolacja podobnych genów; izoenzymów; homologiczny. Uniwersalne startery syntet. oligonukleotydy przyłączające się w pobliżu miejsc klo-nowania w różnych wektorach: plazmidach, fagemidach, bakteriofagu l i M13; do sek-wencjonowania i amplifikacji fragmentów DNA.„touch-down” PCR przy zdegenero-wanych starterach; amplifikacja gen. białek tworzących rodziny; g. z innego gatunku; matryca duża i złożona; startery z „uniwersalnymi” zasadami. „booster” PCR gdy prawdopod. tworzenia dimerów z primerów; mamy mało matrycy (1-1000 kopii) met. badania RNA Hybrydyzacja in situ wykrycie 10-100 cząst.; Northern blotting; Slot–blotting lub Dot-blotting; Nuclease protection assay – wymaga 10^4 cząst.; RT-PCR szybka, wydajna, specyficzna, czuła; RT-PCR jednostopniowa – wygodna, szybka, RNA to inhibit. PCR, RT-PCR dwustopniowa – bardziej pracochłonna, lepsza do optymalizacji; AMV transkryptaza z wir. ptasiej mieloblastozy (pH 8,3; KCl 145 mM; 42°C; duże st. dNTP; akt. RNazy H: trawi hybrydy RNA/DNA, skraca powstające DNA przy końcu 3’, brak akt. 3’-5’ egzonukleazy) Mo-MLV transkrypt. z wir. mysiej białaczki (pH 7,6; KCl 72 mM; 37°C; duże st. dNTP; niska akt. RNazy H; brak akt. 3’-5’ egzonukleazy) polimeraza Tth termostabilna; podwójna akt. ...
Petroc