In vitro roślin - zaliczenie.docx

1.1 Podstawowe definicje; główne kierunki przemian rozwojowych roślinnych tkanek in vitro

Określenie kultury in vitro, najdosłowniej rozumiane, oznacza hodowle prowadzone w szkle (w zamkniętych naczyniach). W praktyce jednak przez roślinne kultury in vitro będziemy rozumieć hodowle roślin (a częściej ich niewielkich fragmentów - organów, tkanek, komórek, lub protoplastów) prowadzone na sztucznych podłożach (pożywkach) w warunkach jałowości. W tym samym, bardzo ogólnym sensie bywa stosowany termin hodowle tkankowe. Wydaje się, że istotę rzeczy jeszcze lepiej ujmowało określenie stosowane kiedyś: roślinne czyste kultury, niestety termin ten praktycznie wyszedł już z użycia.

Techniki kultur in vitro, stanowią jeden z głównych działów nowoczesnej biotechnologii roślin (obok inżynierii genetycznej i blisko z nią związanej diagnostyki molekularnej) i służą celom praktycznym np. masowemu rozmnażaniu roślin, ich doskonaleniu (hodowli nowych odmian), albo pozyskiwaniu z nich cennych metabolitów np. surowców do produkcji leków czy kosmetyków. Metody te odgrywają również ważną rolę w badaniach podstawowych, głównie z dziedziny fizjologii, biochemii oraz biologii molekularnej roślin.

Kultury in vitro przeciwstawia się hodowlom prowadzonym w warunkach naturalnych, niesterylnych np. uprawie polowej czy szklarniowej, które bywają nazywane kulturami ex vitro lub in vivo. Także w uprawach hydroponicznych mamy do czynienia z warunkami ex vitro. Korzenie roślin są w tym przypadku częściowo zanurzone w wodnej pożywce, częściowo zaś "zakotwiczone" w porowatym podłożu unieruchamiającym roślinę i umożliwiającym sprawną wymianę gazową. Uprawy hydroponiczne przypominają kultury in vitro zastosowaniem sztucznych pożywek, ale różnią się od nich brakiem izolacji hodowanego obiektu od zewnętrznego środowiska. Kultury hydroponiczne są sposobem uprawy całych roślin, natomiast w kulturach in vitro, przynajmniej w ich wstępnej fazie, hodujemy zwykle niewielkie fragmenty roślin (np. odcinek korzenia lub łodygi, wycinek blaszki liściowej, pylnik lub zalążek), którym trzeba zapewnić nieco bardziej złożoną pożywkę.

Każdą część rośliny wykorzystywaną jako materiał wyjściowy do założenia roślinnej kultury in vitro nazywa się ogólnie eksplantatem. Dla uzyskania wzrostu kultury wystarczy dowolny eksplantat, byle zawierał żywe komórki z nieuszkodzonym materiałem genetycznym (zdolne do odróżnicowania i podziałów). Jednakże zarówno szybkość wzrostu, jak i procesy rozwojowe zależą od zastosowanego rodzaju eksplantatu pierwotnego (a także od rodzaju pożywki i warunków hodowli). Ze względu na konieczność zapobiegania zakażeniom, lepiej nadają się do hodowli nadziemne części roślin, podobnie lepsze, bo zdrowsze są rośliny pochodzące z uprawy szklarniowej niż polowej. Rośliny z których pobierane będą eksplantaty mogą być wcześniej opryskane układowym fungicydem (środkiem grzybobójczym), jakkolwiek rzadko kiedy jest to niezbędne.

Zwykle eksplantat pobierany jest z fizjologicznie młodych, w znacznym stopniu niezróżnicowanych tkanek roślinnych, bo dużo łatwiej jest uzyskać w nich podziały komórkowe i wzrost kultury. Dobrze jeśli wyjściowy materiał roślinny jest w fazie intensywnego wzrostu, a nie fizjologicznego spoczynku (łatwiej więc zakładać hodowle wiosną niż jesienią czy zimą).

Jeśli eksplantat pobierany jest z roślin rosnących w warunkach niesterylnych, to nazywamy go eksplantatem pierwotnym. Natomiast eksplantatem wtórnym nazywamy fragment rośliny (lub tkanki) pochodzący z kultury in vitro i użyty do zapoczątkowania nowej hodowli in vitro (przeszczepiony na nową pożywkę, na przykład dlatego, że w dotychczasowej zaczęły już wyczerpywać się składniki odżywcze). Proces odświeżania kultury przez przeszczepianie jej fragmentu na nową pożywkę nazywamy pasażowaniem. W przypadku hodowli komórek, prowadzonych w płynnych pożywkach, zamiast terminu eksplantat wtórny stosuje się pojęcie inoculum. Hodowle płynne (w płynnych pożywkach) również poddawane są pasażowaniu, a liczba tych zabiegów (tj. pasaży) od chwili założenia danej hodowli jest jednym z podstawowych parametrów charakteryzujących kulturę. Wydaje się, że komórki, tkanki i organy roślinne mogą być utrzymywane w hodowlach in vitro przez dowolnie długi czas. Na przykład wzrost korzeni pomidora podtrzymywano in vitro przez wiele lat, systematycznie pasażując (co kilka tygodni) wierzchołkowy odcinek rosnących korzeni.

Wzrost jest typowym wynikiem hodowli eksplantatu, objawem wydłużania się komórek, a także podziałów, zwłaszcza jeśli eksplantat zawiera tkankę merytematyczną. Nawet jednak jeśli eksplantat początkowo zawiera wyłącznie tkanki stałe, wyspecjalizowane i nie dzielące się, to pod wpływem warunków hodowli, a zwłaszcza występujących w pożywce regulatorów wzrostu, niektóre komórki mogą ulec fizjologicznemu przeprogramowaniu i odzyskać zdolność podziałów. Proces ten nazywamy odróżnicowaniem. Komórki roślinne, mają zdolność powrotu do stanu merystematycznego, o ile jądro komórkowe i układ błon cytoplazmatycznych nie uległy zbyt silnemu uszkodzeniu. Odróżnicowanie zaczyna się od odbudowy struktur komórkowych, zniszczonych przez enzymy lizosomalne podczas fazy spoczynkowej komórek. Zdolności odróżnicowania nie mają człony rurek sitowych i naczyń, w których jądra zaczęły degenerować, a także włókna, o ścianach komórkowych grubości powyżej 2 μm. Większość jednak komórek roślinnych ma taką zdolność. W wyniku odróżnicowania może dochodzić do powstania w eksplantacie nowych skupisk komórek merystematycznych (centrów merystematycznych). Jeśli podziały wielu komórek zachodzą w sposób nieskoordynowany, to prowadzą do powstania guzowatej narośli, zawierającej głównie komórki miękiszowe i merystematyczne oraz bezładnie rozrzucone pomiędzy nimi komórki innych typów. Taką narośl, nie mającą uporządkowanej budowy wewnętrznej, nie osłoniętą tkanką okrywającą, nazywamy kalusem. W warunkach in vivo narośl podobna do kalusa może tworzyć się spontanicznie w pobliżu miejsc skaleczenia rośliny, stanowiąc tzw. tkankę przyranną, zabliźniającą ubytek tkanki rośliny. Niektóre komórki merystematyczne mogą wtórnie tracić zdolność podziałów i przyjmować postać typową dla tkanek stałych. Zjawisko to nazywamy różnicowaniem. Różnicowanie komórek zapoczątkowuje proces powstawania tkanek stałych, zwany histogenezą. Hodowle kalusa są dogodnym układem doświadczalnym do badania regulacji powyższych przemian rozwojowych przez metabolity, regulatory wzrostu, fizyczne warunki hodowli itp. Stosunkowo wyraźnym przemianom morfologicznym ulegają komórki przekształcające się w drewno. Ten proces, zwany ksylogenezą, jest prawdopodobnie najczęściej badaną w kulturach in vitro formą histogenezy.

W kalusie, a czasami bezpośrednio w tkankach eksplantatu pierwotnego, mogą się też rozwijać zawiązki całych organów. Takie tworzenie się organów od nowa (a nie poprzez pobudzenie wzrostu drobnych zawiązków, istniejących już w eksplantacie pierwotnym) nazywamy organogenezą. Jeśli więc na pożywce umieścimy pąk jakiejś rośliny i uda nam się pobudzić jego rozwój in vitro i przekształcanie się w pęd, to będziemy mogli zaobserwować wzrost i histogenezę, ale nie organogenezę (tkanki pędu wprawdzie rozrastają się tu, ale z uformowanego już w roślinie macierzystej zawiązka, w tym przypadku pąka). Natomiast jeśli użyjemy jako eksplantatu pierwotnego np. kawałka blaszki liściowej albo wycinka wyrośniętej części korzenia i w wyniku hodowli otrzymamy pędy lub korzenie, to będziemy świadkami organogenezy, ponieważ eksplantat pierwotny nie zawiera zawiązków tych organów i muszą one powstawać od nowa. Wyróżnia się dwie główne formy organogenezy w zależności od ich wyniku - pędową (zwaną też kaulogenezą) i korzeniową (czyli ryzogenezę). Jeśli organogeneza poprzedzona jest powstaniem kalusa, to nazywa się ją pośrednią, natomiast o organogenezie bezpośredniej mówimy, gdy nowe organy powstają już w tkankach eksplantatu pierwotnego, bez wyraźnego namnożenia się kalusa. W niektórych kulturach zawiązki pędu i korzenia powstają w sposób skoordynowany, tworząc dwubiegunowe, drobne struktury przypominające roślinne zarodki, jakie normalnie rozwijają się w nasionach. Proces ten może zachodzić zarówno w hodowlach tkanek rozrodczych (generatywnych) jak i wegetatywnych (somatycznych) i nazywany jest embriogenezą. W naturalnych warunkach embriogeneza i rozwój nasion poprzedzone są zwykle zapłodnieniem. W kulturach in vitro bardzo często embriogenezę zapoczątkowuje nie proces zapłodnienia, ale odpowiednie warunki hodowli (przede wszystkim skład pożywki). Wszelkie zarodki rozwijające się z pominięciem procesu zapłodnienia nazywamy zarodkami apomiktycznymi. Zarodki takie, jeśli powstają z żeńskich komórek generatywnych (nie zapłodnionych!), nazywane są zarodkami partenokarpicznymi. Z męskich gamet (lub innych komórek męskiego gametofitu, którym u roślin kwiatowych są kiełkujące ziarna pyłkowe) powstają zarodki zwane androgenicznymi. Natomiast z komórek somatycznych tworzą się zarodki somatyczne, zwane też embrioidami. Z zarodków, w sprzyjających okolicznościach, powstają młode rośliny, które czasem (całkiem fachowo!) nazywane są roślinkami (ang. plantlets). To samo "czułe" określenie bywa stosowane w odniesieniu do wszelkich innych drobnych roślin regenerujących w warunkach in vitro. Jeśli zarodki pozostają na pożywce pobudzającej embriogenezę, to na ich powierzchni mogą się tworzyć potomne zarodki somatyczne, które bywają wtedy nazywane zarodkami przybyszowymi.

1.2 Pożywki

Wszystkie niezbędne do wzrostu substancje hodowany obiekt pobiera z pożywki (tylko kilka składników może być też, w nieznacznym stopniu, pobierane z atmosfery naczynia hodowlanego). Pożywka może mieć postać wodnego roztworu (płynna) albo galaretki (pożywka stała), otrzymanej dzięki dodaniu czynnika żelującego do roztworu substancji odżywczych. Jako substancje odżywcze pożywka zawiera zwykle następujące składniki (tab.1):

o        proste sole mineralne, dostarczające wszystkich niezbędnych pierwiastków (makro- i mikroelementów),

o        witaminy (zwłaszcza z grupy B),

o        jakiś cukier (zwykle sacharoza), stanowiący dla hodowanego obiektu główne źródło węgla

o        regulatory wzrostu

o        czasami jakiś aminokwas, rzadziej inne substancje, np. kwasy organiczne, przeciwutleniacze.

Hodowanemu obiektowi trzeba dostarczyć wszystkich niezbędnych pierwiastków. Uważa się, że roślinom do prawidłowego rozwoju potrzebne jest tylko kilkanaście spośród 90 występujących w przyrodzie pierwiastków. Przyjęło się dzielić je na organogeny (węgiel, wodór i tlen), makroelementy (tworzą powyżej 0,1% suchej masy roślin, a w pożywkach występują zwykle w stężeniu powyżej 0,5 mM) i mikroelementy wymagane w mniejszych ilościach (ich zawartość w roślinach może być ponad 1000x mniejsza niż makroelementów). Oczywiście podane zawartości makro- i mikroelementów odnoszą się do roślin oszczędnie odżywianych (nie przenawożonych). Jeśli rośliny hodowane są w środowisku o wysokiej zawartości np. cynku (lub innych przyswajalnych pierwiastków), to stężenie tego składnika w ich tkankach może wielokrotnie wzrosnąć, mimo to jednak nie będziemy cynku uważać za makroelement. Makroelementami są: N, P, K, Ca, Mg, S. Do mikroelementów natomiast zalicza się zwykle: Fe, Mn, Mo, Cu, Zn, B, Cl. Niektórzy fizjologowie roślin wyróżniają również pierwiastki śladowe, albo korzystne (w odróżnieniu od niezbędnych), zaliczając do nich np. Co, Na, Si, Al, V (zależnie od gatunku rośliny). W praktyce jednak granica pomiędzy mikroelementami, a pierwiastkami śladowymi jest trudno uchwytna i w dalszym opisie pierwiastki z obu grup będziemy nazywać mikroelementami. Makroelementy i mikroelementy z reguły dostarczane są do pożywki w postaci prostych soli mineralnych i pobierane są przez komórki w postaci jonów. Żelazo, ze względu na słabą przyswajalność dla roślin w postaci prostych jonów, zazwyczaj stosowane jest w formie chelatów, tj. soli kompleksowych, w których atom metalu połączony jest kilkoma wiązaniami kompleksowymi (tzw. wiązaniami kleszczowymi) z cząsteczką chelatora. Łatwo przyswajalnymi związkami żelaza są na przykład wersenian żelazowo-sodowy, cytrynian żelaza i winian żelaza. W tabeli 1 wśród składników kilku pożywek podano wersenian sodowy i siarczan żelaza, jednakże roztwory tych dwóch substancji łączy się przed dodaniem ich do pożywki, tak że do pożywki wprowadza się już właściwie produkt ich reakcji, tj. wersenian sodowo-żelazowy (NaFeEDTA). Tabela 1 podaje skład pożywek w bardzo często stosowanym formacie; ściślej jednak mówiąc, zawiera ona nie tyle skład pożywki, co zestaw substancji dodawanych do pożywki podczas jej przyrządzania. Rzeczywisty skład jest znacznie bardziej złożony ze względu na dysocjację soli i wzajemne oddziaływania poszczególnych składników podczas sporządzania pożywki, jej odkażania, przechowywania a także podczas hodowli.

Tabela 1. Skład wybranych pożywek do roślinnych hodowli in vitro